PAX3-FKHR-PAX7-FKHR和miRNA-1在眼眶橫紋肌肉瘤分型及判斷預后中的作用.pdf

1、橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma，RMS)是兒童期最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，占兒童全部惡性腫瘤的5％，占兒童所有軟組織肉瘤的50％。該腫瘤起源于中胚葉未分化的多能間充質細胞，惡性程度高，發(fā)展快，病死率較高，嚴重威脅患者生命。 眼眶橫紋肌肉瘤占所有橫紋肌肉瘤的12％，占頭頸部橫紋肌肉瘤的25-35％，發(fā)病率在眼眶惡性腫瘤中居第一位。該腫瘤預后差別大，患者預后與多種因素有關。目前在診斷上以常規(guī)病理、免疫組化為主要手段。病理

2、診斷上將該腫瘤分為胚胎型(embryonal rhabdomyosarcoma，ERMS)、腺泡型(alveolar rhabdomyosarc-oma，ARMS)和多形型(pleomorphic rhabdomyosarcoma，PRMS)三個亞型。胚胎型最常見，多形型極少見，此兩型預后相對。腺泡型較胚胎型少，但是病情兇險，預后差。由于不同的亞型的預后和治療方式不同，因此，準確的診斷和分型至關重要。但目前常用的常規(guī)病理和免疫組化對部分

3、病例的診斷尤其是分型存在困難，需要探索新的手段，分子生物學的進步為該研究提供了可能。本研究旨在探索融合基因PAX3-FKHR、PAX7-FKHR、微小核糖核酸(miRNA)作為病理診斷補充手段的科學性及研究其與預后的關系。 橫紋肌肉瘤中PAX3-FKHR和PAX7-FKHR產生于染色體t(2；13)、(q35；q14)易位。由生肌轉錄調控因子PAX35ˊ端DNA結合區(qū)與另一轉錄調節(jié)因子FKHR3ˊ端的反式激活區(qū)連接形成。PAX3

4、-FKHR、PAX7-FKHR參與細胞多種代謝，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。通過檢測上述融合基因的存在，有助于對該腫瘤進行診斷和分型并對預后進行判斷。 miRNA是一種進化上十分保守的、非編碼的單鏈小RNA家族，長度為18～25個核苷酸堿基，通過調節(jié)不同的靶基因的表達，在細胞生理和病理過程中起重要作用。miRNA參與器官產生、組織分化、細胞增殖、脂類代謝、凋亡和腫瘤的發(fā)生。文獻顯示miRNA還可用于腫瘤的分型。到目前為止，未見橫紋肌

5、肉瘤中miRNA表達的報道。本研究通過檢測miRNA在眼眶橫紋肌肉瘤中的表達，探討其在判斷腫瘤預后中應用價值。 本研究對2001年1月到2007年9月在武警總醫(yī)院眼眶病研究所住院手術的29例眼眶橫紋肌肉瘤患者臨床資料進行分析，對所有病例進行隨訪。對29例病例的手術標本進行標準HE染色，觀察組織病理學特征。針對抗原Vimentin、MyoDl、Myoglobin、actin、Desmin、CD99、Ki-67、P53，對所有標本進

6、行免疫組化染色。 10例眼眶非肌源性小細胞惡性腫瘤標本為病例對照組，5例正常眼眶橫紋肌標本為正常對照組(來源于眼外肌手術切除的眼外肌標本)。 從石蠟包埋腫瘤組織中提取的總RNA為模板，β-actin為內標，進行RT-PCR和半巢式PCR檢測PAX3-FKHR和PAX7-FKHR，用DNA測序的方法對PCR產物進行確認。 通過包含1320個探針的芯片用來檢測miRNA在眼眶橫紋肌肉瘤中的表達，對13例標本和5例對照

7、組標本進行檢測，使用微陣列差異分析軟件進行分析，通過Real time PCR的方法對特異性表達的miRNA進行確認。使用SPSS13．0軟件進行統(tǒng)計，生存率比較采用Kaplan-meiler法。 29例標本中有19例形態(tài)學表現(xiàn)和免疫組化染色結果比較典型，組織病理上診斷為胚胎型橫紋肌肉瘤；2例有特征性纖維血管隔，并且形成腺泡樣結構，診斷為腺泡型橫紋肌肉瘤；8例病變形態(tài)學表現(xiàn)不典型，腫瘤細胞分化較差，主要結合免疫組化染色診斷為OR

8、MS，但無法分型。 29例標本中有27例成功提取出RNA，其中7例檢測到PAX3─FKHR和PAX7-FKHR的表達，表達率為26％。病例對照組和正常人對照組均未檢出PAX3-FKHR和PAX7-FKHR的表達，實驗組與對照組間差異顯著(P＜0.01)。病理上未分型的8例中5例PAX3-FKHR和PAX7-FKHR的表達陽性，3例表達陰性。結合文獻，5例陽性表達者歸為腺泡型，3例陰性者歸為胚胎型。 通過芯片的檢測，發(fā)現(xiàn)在

9、腫瘤組織中，hsa-miR-106a、hsa-miR-18b、hsa-miR-92a三種表達顯著增高，最高的有11.8倍，hsa-miR-29a、hsa-miR-22、hsa-miR-133b、hsa-miR-133a、hsa-miR-29b、hsa-miR-1、hsa-miR-29c七種表達顯著下降。使用Realtime PCR確認hsa-miR-1在腫瘤組織中表達顯著下降。結合隨訪資料，表達下降的程度與病人的預后相關，hsa-miR

10、-1下降越多，預后越差。 本研究認為常規(guī)病理和免疫組化對大部分典型病例可明確診斷和分型，但對部分腫瘤細胞分化差的病例在診斷上特別是病理分型上有其局限性，PAX3-FKHR/PAX7-FKHR、miRNA-1可作為ORMS分型診斷和判斷預后的有效參考指標。另外，與正常眼眶橫紋肌組織比較，首次發(fā)現(xiàn)ORMS中154個miRNA有差異性表達，其中10個差異性最明顯，對進一步研究提供了思路。對其中的hsa-miR-1在ORMS中的表達量進