可溶性HLA-G-,1-抑制人NK細胞對豬血管內皮細胞殺傷作用的研究.pdf

1、第一部分穩(wěn)定表達可溶性HLA-G1的真核細胞系的建立 目的:建立穩(wěn)定表達可溶性HLA-G1(solublehumanleucocyteantigenG1，sHLA-G1)的真核細胞系。方法:采用核轉染技術將含有sHLA-G1基因的質粒pcDNA3-sHLA-G1轉入不表達HLA-Ⅰ類分子的B淋巴瘤細胞LCL721.221中，轉染率約為16％。經G418篩選后獲得穩(wěn)定轉染細胞，通過RT-PCR及Dot-ELISA分別在基因和蛋白質

2、水平鑒定穩(wěn)定轉染細胞是否表達目的基因sHLA-G1。結果:經RT-PCR和Dot-ELISA鑒定證實轉染細胞可表達sHLA-G1。結論:采用核轉染方法可以成功建立穩(wěn)定表達可溶性sHLA-G1的真核細胞系。 第二部分三種非病毒載體轉染方法對貼壁細胞及懸浮細胞轉染的比較 目的:通過檢測三種非病毒載體轉染方法(傳統(tǒng)電穿孔法、脂質體法及新興的核轉染法)對貼壁細胞及懸浮細胞的轉染效率和轉染后細胞的存活率，以比較這三種轉染方法的優(yōu)缺

3、點。方法:選取貼壁生長的宮頸癌細胞系Hela細胞及懸浮生長的B淋巴瘤細胞系LCL721.221細胞作為宿主細胞，以含有綠色熒光蛋白(GFP)基因的pEGFP-C1為報告質粒，分別用傳統(tǒng)電穿孔法、脂質體法及核轉染法轉染細胞。用臺盼藍染色檢測轉染后細胞存活率并于轉染后24h和48h用流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測轉染細胞的GFP表達率(即轉染效率)。結果:采用傳統(tǒng)電穿孔法細胞存活率為：Hela，85.3％，LCL721.221，87.6％，轉染

4、效率為：Hela,約5％；LCL721.221，約1％；采用脂質體法細胞存活率為：Hela,73.4％，LCL721.221，68.2％，轉染效率為：Hela,約40％，LCL721.221，約0.4％；采用核轉染法細胞存活率為：Hela,91.6％，LCL721.221，90.7％，轉染效率為：Hela,約95％，LCL721.221，約16％。采用核轉染法轉染的細胞存活率及轉染效率均最高。結論:細胞系的轉染，特別是難轉染細胞系的轉染

5、，核轉染法可以作為非病毒載體轉染方法的首選。 第三部分可溶性HLA-G1抑制人NK細胞對豬血管內皮細胞殺傷作用的研究 目的:研究可溶性HLA-G1能否抑制人自然殺傷細胞(NK細胞)對豬血管內皮細胞系殺傷的作用。方法:用免疫親和層析法從轉染sHLA-G1基因的LCL721.221細胞培養(yǎng)液上清液中提純sHLA-G1蛋白，將不同濃度的sHLA-G1(2，4，6，8μg/ml)加入到效應細胞為NK92細胞，靶細胞為豬血管內皮細