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文檔簡介
1、目的：探討慢病毒介導人凝血IX因子(Human clotting factorIX，hFIX)基因在人臍帶間充質干細胞(Human umbilical cordmesenchymal stem cells，hUCMSCs)中的表達。
方法：重組構建慢病毒載體GV240-hFIX-EGFP，行PCR鑒定和測序驗證。以脂質體介導法共轉染293T細胞包裝生產(chǎn)慢病毒，實時定量PCR測定滴度。以不同感染復數(shù)(multiple of
2、infection，MOI)感染hUCMSCs，熒光顯微鏡觀察細胞感染效率，流式細胞儀檢測驗證。實驗分三組:實驗組(GV240-hFIX-EGFP感染hUCMSCs)、空載體對照組(GV240-EGEP感染hUCMSCs)及空白組(空hUCMSCs)，以最適MOI感染hUCMSCs。RT-PCR檢測hFIX-mRNA水平，ELISA檢測FIX蛋白含量(FIX∶Ag)及一期法檢測FIX凝血活性(FIX∶C)。
結果：制備出了
3、滴度為2×108 TU/mL的重組慢病毒。MOI=10時能高效感染hUCMSCs，感染效率為(92.92±6.32)％。RT-PCR結果示只有轉染組有hFIX-mRNA轉錄。感染后1d，hUCMSCs即可有效分泌hFIX，在5d時達到最高峰，F(xiàn)IX∶Ag為(87.18±0.86) ng/(106·24h);FIX∶C為(44.3±3.2)％，這樣高水平分泌可至少持續(xù)29d。
結論：重組GV240-hFIX-EGFP慢病毒能
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