以微管為靶點的苯并呋喃類木脂素衍生物抗腫瘤細胞增殖活性及作用機理研究.pdf

1、惡性腫瘤是當前危害人類健康的主要疾病之一。目前治療腫瘤的方法主要有手術(shù)、放射、藥物和免疫療法?；瘜W藥物治療是腫瘤治療中發(fā)展最快的一個領(lǐng)域，在腫瘤的治療中發(fā)揮著越來越大的作用。然而，化療藥物的毒副反應及腫瘤細胞對藥物的抗藥性嚴重影響了化學治療的效果。因此，尋找高效低毒的新型抗癌藥物是當務之急。 在長期的抗癌藥物篩選實踐中人們發(fā)現(xiàn)，從植物中開發(fā)新的抗腫瘤藥物具有極大的潛力。近幾十年來，研究者們發(fā)現(xiàn)了多種重要的抗腫瘤天然產(chǎn)物，如長春堿

2、、長春新堿、紫杉醇、鬼臼毒素及其衍生物等。目前臨床上用于治療腫瘤的植物藥已篩選出二十余種，分別為生物堿類(如長春堿類、三尖杉酯堿類、喜樹堿類等)、木脂素類(如鬼臼毒素半合成衍生物)、柄型大環(huán)化合物(如美登木素)、二萜類化合物(如紫杉醇、雷公藤內(nèi)酯及冬凌草甲素等)。從作用機制來看，這些植物藥分別作用于微管系統(tǒng)，如長春堿類及紫杉醇；或作用于拓撲異構(gòu)酶，如喜樹堿類及鬼臼毒素衍生物；有的則通過影響核糖體功能阻止蛋白質(zhì)合成，如三尖杉酯堿類。

3、 在上述各類抗腫瘤植物藥中，木脂素類化合物以其顯著的生物活性引起了廣泛關(guān)注。木脂素是一類由苯丙素雙分子氧化聚合而成的天然產(chǎn)物，廣泛存在于多種高等植物的根、莖、葉、種子和果實中。木脂素的生物活性廣泛而顯著，主要包括：抗腫瘤作用、肝臟保護和抗氧化作用、抗微生物作用、抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用、血小板活化因子(PAF)拮抗活性以及PKC抑制活性、抗焦慮作用等。在各種類型的木脂素中，苯并呋喃類木脂素占據(jù)著重要地位，這類木脂素均含有苯并呋喃結(jié)構(gòu)骨架，具

4、有多種生理活性，如抗增殖、抗血管生成、抗血栓、抗氧化以及心血管方面的活性。大量的研究發(fā)現(xiàn)，許多天然或合成的苯并呋喃類木脂素都具有顯著的抗腫瘤活性，且抗腫瘤活性與干擾細胞內(nèi)微管蛋白的聚合與解聚活性有關(guān)。 微管(microtubule)是存在于所有真核細胞中，由微管蛋白(tubulin)裝配、聚合而成的長管狀細胞器結(jié)構(gòu)，能與其它蛋白共同組裝成纖毛、鞭毛、軸突、神經(jīng)管、基粒、中心粒、紡錘體等結(jié)構(gòu)，參與細胞骨架的構(gòu)成、細胞形態(tài)的維持、

5、細胞收縮、偽足運動、細胞內(nèi)物質(zhì)運輸以及細胞分裂等。在GTP、Mg<'2+>及微管相關(guān)蛋白(MAP)等存在時，微管依賴于微管蛋白二聚體對其不停地結(jié)合與分離而處于一種裝配與去裝配的動態(tài)平衡中，即聚合一解聚的動態(tài)平衡。在有絲分裂過程中，當細胞由分裂間期進入有絲分裂前期后，細胞質(zhì)中的微管迅速解聚并重組為紡錘體，紡錘體微管附著于染色單體的著絲粒，參與染色單體的分離。分裂進入末期后，紡錘體又解聚裝配成微管。由此可見，為行使正常的微管功能，微管處于動

6、態(tài)的裝配和解聚狀態(tài)是非常重要的。 微管與紡錘體之間的互變是細胞分裂的重要環(huán)節(jié)。抗微管化合物均能干擾這一環(huán)節(jié)，影響微管的正常功能，引起有絲分裂阻滯，并通過一系列的信號傳導誘導細胞凋亡。與正常細胞相比較，分裂增殖旺盛的腫瘤細胞對這種干擾作用更加敏感。因此，作用于微管，干擾細胞有絲分裂的化合物，都有可能開發(fā)成為抗腫瘤藥物。能夠干擾微管功能的苯并呋喃類木脂素因而具有良好的開發(fā)前景，值得深入研究。中山大學化學化工學院綜合分析了大量天然苯并

7、呋喃木脂素的結(jié)構(gòu)與活性，在此基礎(chǔ)上設計合成了一系列帶有不同取代基的2-芳基苯并呋喃類木脂素，擬對其抗腫瘤活性及構(gòu)效關(guān)系進行研究，期望篩選出具有良好活性的化合物。本研究共篩選了14個苯并呋喃化合物，發(fā)現(xiàn)化合物：ERJT-12具有明顯的體外抗增殖作用及抗微管作用，并探討了其作用的分子機制。 方法與結(jié)果：1．2-芳基苯并呋喃類木脂素化合物的體外抗增殖活性 方法：取對數(shù)生長期的腫瘤細胞接種于96孔板，每種化合物均設不同濃度的用藥

8、組及相應的溶劑對照組。MTT法檢測每孔OD值，Bliss法計算半數(shù)抑制濃度(IC<,50>值)。 結(jié)果：在所篩選的14種化合物中，化合物ERJT-12的細胞毒作用最強；ERJT-18和ERJT-30的細胞毒性較ERJT-12稍弱；ERJT-06、ERJT-16、ERJT-26、ERJT-28呈現(xiàn)輕度的細胞毒作用；化合物ERJT-09、ERJT-21、ERJT-23、ERJT-29的細胞毒作用不明顯?；衔颬JY-02、PJY-0

9、4和ERJT-01溶解度較差，對上述3種腫瘤細胞的．IC<'5o>值未能檢測。 進一步檢測化合物ERJT-12對多種人腫瘤細胞的體外抗增殖作用。結(jié)果顯示：人乳腺癌細胞MCF-7、人口腔上皮癌細胞KB-3-1對化合物ERJT-12比較敏感，IC<,50>值分別為5.75±O.38uM、6.75±O.68μM；人肺腺癌細胞GLC82和人膀胱癌細胞ECV-304對ERJT-12的敏感性較低，IC<,50>值分別為15.18±1.56

10、μM、17.29±1.64μM。 化合物ERJT-12對多藥抗藥細胞也具有明顯的生長抑制作用。對KB一3-1細胞(敏感株)的IC<,5o>值為6.75±0.68 uM，對C-A120細胞(阿霉素275倍耐藥株)的IC<,50>值為8.87±O.66μM，耐藥倍數(shù)為1.3倍；ERJ-12對CCRF-CEM細胞(敏感株)的．IC<,50>值為8.82±0.37μM，對CCRF—VCRl000細胞(長春新堿8123倍耐藥株)的IC<,

11、50>值為13.75±1.69μM，耐藥倍數(shù)為1.6倍。 2．ERJT-12對MCF-7細胞周期及相關(guān)的細胞周期調(diào)控蛋白的影響 2．1．流式細胞儀檢測細胞周期分布 方法：收集不同濃度ERJT-12處理的MCF-7細胞，PBS洗滌，70％乙醇固定。離心懸浮細胞于PBS，溴化丙啶(PI)染色后，流式細胞儀檢測DNA含量，LYSIS軟件分析。 結(jié)果：不同劑量ERJT-12分別作用MCF-7細胞24h后，細胞出現(xiàn)

12、不同程度的G<,2>/M期阻滯，呈劑量依賴性。同時，各處理組G<,1>期細胞所占比例呈劑量依賴性下降，S期細胞比例無明顯改變。 2.2.Western blot法檢測細胞周期調(diào)控蛋白的表達情況 方法：不同濃度的ERJT-12處理MCF-7細胞24h后制備蛋白樣品，定量。每泳道加等量樣品后開始聚丙烯酰胺凝膠電泳，按常規(guī)轉(zhuǎn)印及封閉，分別標記一抗、二抗，暗室中曝光、沖片。 結(jié)果：不同劑量ERJT-12分別處理MCF-7

13、細胞24h后，Cdc25c總蛋白的表達無明顯改變，而Ser-216(216位絲氨酸)磷酸化的Cdc25c的表達則呈劑量依賴性上調(diào)，即失活狀態(tài)的Cdc25c增多；相同作用條件下，CDKl總蛋白的表達無明顯改變，而Thrl4/Tlyrl5(14位蘇氨酸/15位酪氨酸)磷酸化的CDKl表達則呈上調(diào)趨勢，即未被激活的CDKl增加；CyclinBl蛋白的表達隨處理劑量的增加而下調(diào)。 3．ERJT-12誘導有絲分裂阻滯及對微管蛋白聚合的影響

14、 3.1.Giemsa染色觀察有絲分裂阻滯 3.2.比色法檢測微管蛋白聚合活性 結(jié)果：ERJT-12能夠抑制微管蛋白的聚合，其抑制作用與秋水仙堿類似，且隨劑量增加抑制作用增強。 3.3．細胞免疫熒光實驗 方法：細胞經(jīng)固定、透化處理后封閉，依次與抗微管蛋白抗體及相應FITC標記的二抗孵育一定時間，熒光顯微鏡下觀察。 結(jié)果：ERJT-12處理組細胞微管的改變與秋水仙素組類似，微

15、管趨向于解聚，在胞漿中的密度降低。 4．化合物ERJT-12誘導MCF-7細胞凋亡及機理研究 4.1．流式細胞儀檢測細胞凋亡 4.2．DNA梯形條帶檢測 4.3．Caspase-3、Caspase-6活性檢測 4.4．Western blot法檢測細胞中Bcl-2、Bax蛋白的磷酸化狀態(tài)及表達情況 [結(jié)論] 1.14個全新合成的苯并呋喃木脂素化合物中，4-位甲?；〈幕衔?E

16、RJT-12細胞毒作用最明顯，對體外培養(yǎng)的多種人腫瘤細胞均有不同程度的生長抑制作用，對乳腺癌MCF-7細胞的抗增殖作用最顯著；ERJT-12對多藥抗藥的人口腔上皮癌細胞C-A120和淋巴細胞白血病細胞CCRF-VCRl000有較明顯的細胞毒作用，與抗癌藥物ADM、VCR和VP-16之間沒有明顯的 交叉抗藥性。 2．ERJT-12能夠誘導MCF-7細胞出現(xiàn)明顯的G<,2>/M期阻滯，呈劑量依賴性。阻滯作用的原因可能是使G<,2>

17、/M期調(diào)控蛋白Cdc25c磷酸化失活，同時下調(diào)CyclinBl蛋白的表達，導致G<,2>/M期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵分子CDKl無法激活。 3．ERJT-12能夠抑制微管蛋白的聚合，作用類似于秋水仙堿，從而干擾紡錘體的功能，誘導MCF-7細胞阻滯于有絲分裂期。 4．ERJT-12能以劑量依賴性和時間依賴性關(guān)系誘導MCF-7細胞凋亡。凋亡的誘發(fā)因素可能是G<,2>期和M期的雙重阻滯，導致細胞出現(xiàn)不可逆的損傷。Caspase家族成員和B