基因1b型HCV不同準種核心蛋白原核及真核質粒的構建及表達.pdf

1、背景和目的:
　　 丙型肝炎病毒（HCV ）是引起我國慢性肝病的主要病因，核心蛋白（CORE ）在HCV 致病過程中發(fā)揮重要作用，而CORE 主要通過與宿主細胞蛋白相互作用發(fā)揮其致病作用。我國主要流行基因1b 型HCV ，且同一基因型不同準種致病性存在差異。利用分子克隆的方法構建基因1b 型不同準種CORE 原核和真核質粒，鑒定、誘導表達并純化獲得不同準種CORE ，進一步獲得與CORE 相互作用的細胞蛋白質組。
　　

2、方法:
　　 1. 用PCR 方法擴增獲得基因1b 型不同準種CORE 基因片段；
　　 2. 構建不同準種CORE 真核質粒：pcDNA3.1 （+），并轉染HepG2 細胞，Westernblot 驗證細胞內(nèi)CORE 的表達；
　　 3. 構建7 種不同準種CORE 原核質粒，鑒定、誘導表達并篩選出高水平表達CORE 的原核質粒；
　　 4. 誘導原核質粒pTrc-CKS-CORE ，并利用色譜柱純化

3、獲得不同準種CORE融合蛋白；
　　 5. 將純化好的CORE 與HepG2 細胞總蛋白進行His pull-down 試驗，獲得與CORE 相互作用的細胞蛋白質組。
　　 結果:
　　 1. 不同準種CORE 真核質粒構建成功，轉染HepG2 細胞獲得了表達；
　　 2. 不同準種CORE 原核質粒構建成功，不同原核載體表達CORE 不同，以載體pTrc-CKS 表達量最高，載體pMBp-C 次之，其余

4、原核載體未有明顯表達。
　　 3. 純化獲得了CKS-CORE-His 融合蛋白。
　　 4. 通過His pull-down 試驗，得到了與融合蛋白相互作用的細胞蛋白質組。
　　 結論:
　　 1. 成功構建CORE 真核表達質粒并獲得表達，為進一步細胞內(nèi)驗證與CORE相互作用的蛋白質研究奠定基礎；
　　 2. 成功構建HCV 不同準種CORE 原核質粒pTrc-CKS ，可以高效表達CORE