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文檔簡介
1、背景和目的:
丙型肝炎病毒(HCV )是引起我國慢性肝病的主要病因,核心蛋白(CORE )在HCV 致病過程中發(fā)揮重要作用,而CORE 主要通過與宿主細胞蛋白相互作用發(fā)揮其致病作用。我國主要流行基因1b 型HCV ,且同一基因型不同準種致病性存在差異。利用分子克隆的方法構建基因1b 型不同準種CORE 原核和真核質粒,鑒定、誘導表達并純化獲得不同準種CORE ,進一步獲得與CORE 相互作用的細胞蛋白質組。
2、方法:
1. 用PCR 方法擴增獲得基因1b 型不同準種CORE 基因片段;
2. 構建不同準種CORE 真核質粒:pcDNA3.1 (+),并轉染HepG2 細胞,Westernblot 驗證細胞內(nèi)CORE 的表達;
3. 構建7 種不同準種CORE 原核質粒,鑒定、誘導表達并篩選出高水平表達CORE 的原核質粒;
4. 誘導原核質粒pTrc-CKS-CORE ,并利用色譜柱純化
3、獲得不同準種CORE融合蛋白;
5. 將純化好的CORE 與HepG2 細胞總蛋白進行His pull-down 試驗,獲得與CORE 相互作用的細胞蛋白質組。
結果:
1. 不同準種CORE 真核質粒構建成功,轉染HepG2 細胞獲得了表達;
2. 不同準種CORE 原核質粒構建成功,不同原核載體表達CORE 不同,以載體pTrc-CKS 表達量最高,載體pMBp-C 次之,其余
4、原核載體未有明顯表達。
3. 純化獲得了CKS-CORE-His 融合蛋白。
4. 通過His pull-down 試驗,得到了與融合蛋白相互作用的細胞蛋白質組。
結論:
1. 成功構建CORE 真核表達質粒并獲得表達,為進一步細胞內(nèi)驗證與CORE相互作用的蛋白質研究奠定基礎;
2. 成功構建HCV 不同準種CORE 原核質粒pTrc-CKS ,可以高效表達CORE
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