皮質(zhì)醇調(diào)控人胎盤合體滋養(yǎng)層細胞芳香化酶表達的分子機制.pdf

1、目的及方法：
　　本研究以人胎盤組織及胎盤合體滋養(yǎng)層細胞為研究模型，采用免疫組織化學染色、體外胎盤滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)、實時熒光定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR)、蛋白印跡雜交（Western blotting）、酶聯(lián)免疫測定(Enzymeimmunoassay，EIA)、小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉染、啟動子熒光素酶報告基因活性測定、化學發(fā)光微

2、粒子免疫法(ChemiluminescentMicroparticle immunoassay，CMIA)以及染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation，ChIP)等實驗技術，聯(lián)合類固醇激素及其受體拮抗劑、信號通路激動劑及其拮抗劑和轉錄因子抑制劑等工具藥，研究了糖皮質(zhì)激素對人類胎盤合體滋養(yǎng)層細胞芳香化酶的表達調(diào)控作用及其分子機制。
　　結果：
　　1.人胎盤組織的免疫組織化學染色結果表明，芳香

3、化酶主要在胎盤絨毛小葉的合體滋養(yǎng)層中大量表達，而絨毛小葉的細胞滋養(yǎng)層細胞、間質(zhì)細胞和胎兒血管幾乎無表達。此外，通過qRT-PCR和Western blotting的測定發(fā)現(xiàn)，芳香化酶的mRNA和蛋白水平隨著細胞滋養(yǎng)層細胞向合體滋養(yǎng)層細胞的分化而不斷增加。
　　2.qRT-PCR和Western blotting測定結果表明，皮質(zhì)醇（0.01-1μM，24h）能夠劑量依賴性誘導人胎盤合體滋養(yǎng)層細胞芳香化酶mRNA和蛋白的表達。而且，

4、EIA的測定結果表明，皮質(zhì)醇(1μM，24h)也可以誘導胎盤合體滋養(yǎng)層細胞中DHEA向雌二醇的轉化。
　　3.免疫組織化學、普通PCR以及Western blotting的實驗表明，人胎盤合體滋養(yǎng)層細胞表達大量的糖皮質(zhì)激素受體(GR);在此基礎上，我們采用qRT-PCR、Western blotting以及GR siRNA轉染細胞等實驗方法研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇(0.1μM，24h)對人胎盤合體滋養(yǎng)層細胞芳香化酶mRNA和蛋白表達的誘導

5、作用能夠被GR拮抗劑RU486(1μM)和GR siRNA(120 nM)阻斷;此外，皮質(zhì)醇對芳香化酶mRNA的誘導作用可以被蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮CHX(10μM)阻斷，這些結果提示皮質(zhì)醇對人胎盤合體滋養(yǎng)層細胞芳香化酶mRNA表達的誘導作用需要GR參與介導，但此介導作用可能是通過誘導其它蛋白合成間接實現(xiàn)的。
　　4.qRT-PCR和Western blotting的檢測結果表明，cAMP的類似物db-cAMP(100μM，24

6、h)和腺苷酸環(huán)化酶的激動劑Forskolin(100μM，24h)都能夠顯著促進胎盤合體滋養(yǎng)層細胞芳香化酶的表達;此外，我們利用EIA方法測定胞內(nèi)cAMP水平發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇(1μM，12h)可以顯著增加胎盤合體滋養(yǎng)層細胞的胞內(nèi)cAMP水平;進一步研究顯示，PKA的抑制劑H89(10μM)以及Gαs的抑制劑NF449(20μM)均可以阻斷皮質(zhì)醇(1μM，24h)對胎盤芳香化酶表達的誘導作用。這些結果提示，皮質(zhì)醇對胎盤合體滋養(yǎng)層細胞中芳香化酶

7、的表達調(diào)控是間接通過cAMP/PKA信號通路實現(xiàn)的。
　　5.眾所周知，糖皮質(zhì)激素的經(jīng)典作用需要通過細胞內(nèi)的GR受體介導，于是我們推測在胎盤合體滋養(yǎng)層細胞中，糖皮質(zhì)激素很可能通過GR誘導了與cAMP/PKA信號通路激活相關的激素的合成與分泌從而來促進胎盤芳香化酶的表達和雌激素的合成。已有報道，皮質(zhì)醇可以通過GR誘導胎盤合體滋養(yǎng)層細胞CRH和hCG的表達與分泌，并且CRH和hCG的受體都能激活cAMP/PKA信號通路。因此，我們對C

8、RH和hCG是否參與了皮質(zhì)醇對人胎盤合體滋養(yǎng)層細胞芳香化酶的表達調(diào)控作用進行了研究。通過qRT-PCR測定發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇(0.01-1μM，12h)可以劑量依賴性的誘導胎盤合體滋養(yǎng)層細胞CRH和hCGα與β亞基的表達，進一步用EIA和CMIA測定發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇(1μM)處理胎盤合體滋養(yǎng)層細胞12小時后就可以顯著增加胎盤合體滋養(yǎng)層細胞CRH和hCG的分泌，且該作用可以一直持續(xù)到24小時。而且，qRT-PCR、Western blotting以

9、及EIA測定結果表明，CRH受體的非選擇性拮抗劑α-h-CPH(1μM)和hCG抗體(1∶100)單獨都可以部分阻斷皮質(zhì)醇(1μM)對胞內(nèi)cAMP水平和芳香化酶表達的誘導作用;當這兩者聯(lián)合用藥時，則不僅可以降低胎盤合體滋養(yǎng)層細胞胞內(nèi)cAMP的基礎水平和芳香化酶的基礎表達，還能進一步完全阻斷皮質(zhì)醇對cAMP水平和芳香化酶表達的誘導作用。這些結果提示CRH和hCG不僅通過cAMP/PKA信號通路共同維持著胎盤合體滋養(yǎng)層細胞芳香化酶的基礎表達

10、，而且還介導了皮質(zhì)醇對胎盤合體滋養(yǎng)層細胞芳香化酶的誘導作用。
　　6.由于胎盤芳香化酶基因可以利用不同的轉錄起始位點來進行轉錄，因此我們通過設計識別不同轉錄產(chǎn)物的特異引物進行PCR，研究發(fā)現(xiàn)胎盤合體滋養(yǎng)層細胞主要表達芳香化酶基因啟動子PI.1的轉錄產(chǎn)物，并伴有少量啟動子PI.2和P2a的表達產(chǎn)物，qRT-PCR檢測結果還表明皮質(zhì)醇(1μM，24h)對包含芳香化酶基因外顯子Ⅰ.1和包含外顯子2a的轉錄產(chǎn)物具有誘導作用，而對包含芳香化

11、酶基因外顯子Ⅰ.2的轉錄產(chǎn)物則無作用;此外，熒光素酶報告基因活性測定實驗發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇(1μM，24h)和Forskolin(100μM，24h)都可以顯著誘導胎盤合體滋養(yǎng)層細胞芳香化酶基因-501bp啟動子PI.1的活性，這說明皮質(zhì)醇通過作用于芳香化酶基因啟動子PI.1誘導了胎盤芳香化酶的表達。
　　7.我們對芳香化酶基因啟動子PI.1序列生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，此序列上具有多個Sp1結合位點，因此進一步研究了Sp1在胎盤芳香化酶表達調(diào)

12、控中的作用。用qRT-PCR和Western blotting的方法研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇(1μM)、db-cAMP(100μM)和Forskolin(100μM)處理細胞24h后都能夠顯著誘導胎盤合體滋養(yǎng)層細胞Sp1的表達，且皮質(zhì)醇對Sp1的誘導作用也可以被H89以及NF449所阻斷;此外，Sp1的拮抗劑光神霉素A（Mythramycin A，M，50μM）和Sp1的siRNA(60 nM)不僅能夠抑制胎盤芳香化酶的基礎表達，而且還能夠抑制

13、皮質(zhì)醇和Forskolin對芳香化酶表達的促進作用。進一步用ChIP方法研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇(1μM)以及db-cAMP(100μM)和Forskolin(100μM)處理胎盤合體滋養(yǎng)層細胞24h都能促進Sp1與芳香化酶基因啟動子PI.1的結合。同時，α-h-CRH(1μM)以及hCG抗體(1∶100)單獨都可以部分阻斷皮質(zhì)醇對Sp1表達的誘導作用以及皮質(zhì)醇對Sp1與芳香化酶基因啟動子PI.1結合的促進作用;且當兩者聯(lián)合給藥時，則不僅可以降

14、低Sp1的基礎表達以及Sp1與芳香化酶基因啟動子PI.1基礎結合，而且還可以進一步完全阻斷皮質(zhì)醇對Sp1的誘導作用以及皮質(zhì)醇對Sp1與芳香化酶基因啟動子PI.1結合的促進作用。這些結果說明，Sp1介導了皮質(zhì)醇對胎盤合體滋養(yǎng)層細胞芳香化酶表達的誘導作用。皮質(zhì)醇(1μM)、Forskolin(100μM)和db-cAMP(100μM)除了可以增加Sp1與胎盤合體滋養(yǎng)層細胞芳香化酶基因啟動子PI.1的結合外，還可以增加胎盤芳香化酶基因啟動子P

15、I.1上組蛋白3第九位賴氨酸的乙?；?Acetyl H3K9)水平，并降低組蛋白3第九位賴氨酸的雙甲基化(Dimethyl H3K9)水平，同時還能增加RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)與芳香化酶基因啟動子PI.1的結合，這說明胎盤芳香化酶啟動子PI.1上組蛋白3的乙?；碗p甲基化也參與了皮質(zhì)醇對胎盤芳香化酶基因的表達調(diào)控。
　　結論：
　　研究結果表明，人胎盤芳香化酶主要在胎盤合體滋養(yǎng)層細胞中表達，且隨著胎盤滋養(yǎng)層細胞向合體滋養(yǎng)層

16、細胞的融合而逐漸增加，此外，在合體滋養(yǎng)層細胞中，芳香化酶基因主要表達包含外顯子Ⅰ.1的轉錄產(chǎn)物。我們的研究結果還表明，在人類胎盤合體滋養(yǎng)層細胞中，皮質(zhì)醇可以上調(diào)胎盤芳香化酶的表達，從而增加雌激素的合成。皮質(zhì)醇通過結合其自身受體GR，進而誘導了胎盤合體滋養(yǎng)層細胞中CRH和hCG的合成與分泌，分泌到細胞外的CRH和hCG激活胎盤合體滋養(yǎng)層細胞胞內(nèi)cAMP/PKA信號通路，該通路導致Sp1表達的增加以及Sp1與芳香化酶基因啟動子PI.1的結合