豬主要病毒性疾病病原的分子檢測技術研究.pdf

1、隨著我國現(xiàn)代化畜牧業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)豬產業(yè)的集約化、規(guī)模化程度愈來愈高，生豬及其產品的流通日益頻繁，流動范圍進一步加大，豬傳染病的發(fā)生與流行有加重的趨勢。多病原混合感染和繼發(fā)感染已成為當今豬群發(fā)病的普遍規(guī)律。免疫抑制性病毒，如豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒2型等，是目前危害養(yǎng)豬業(yè)的不可忽視的原發(fā)性病原，與其他病原混合感染后可導致豬群的高發(fā)病率和高死亡率，使臨床診斷的難度大大增加。隨著對各種病毒基因組分子生物學研究的不斷深入，一系列基于

2、核酸的病原檢測技術不斷出現(xiàn)，為疾病的診斷提供了實用快速的新方法。 本文針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒N基因保守序列設計引物與TaqMan探針，在建立常規(guī)PCR的基礎上，設計并優(yōu)化了TaqMan熒光定量PCR方法用于PRRSV核酸的檢測。建立的熒光定量PCR方法與其它豬主要病原之間無任何非特異性反應；針對陽性克隆質粒的檢測靈敏度可以達到1.2×10<'1>copy/ml，比常規(guī)PCR高100倍；通過對48份臨床疑似樣本的檢測表明有29

3、份樣本為PRRSV陽性，而常規(guī)PCR只能檢出其中19份陽性樣本。上述結果表明，實驗建立的PRRSVTaqMan熒光定量PCR方法具有良好的特異性、敏感性和重復性，提供了一個更為有效的PRRSV臨床檢測方法。 針對豬圓環(huán)病毒2型ORF2、豬偽狂犬病毒gD和豬細小病毒VP2基因保守區(qū)域，設計了特異性引物，在分別建立單一病毒基因PCR檢測方法的基礎上，通過對三組引物的比例和濃度、dNTPs和Mg<'2+>的濃度、退火溫度等條件的優(yōu)化，

4、建立了針對上述3種病毒的三重PCR檢測方法。敏感性試驗表明，應用該方法最低可檢測到4×10<'-4>ng/μl的PRV雙鏈DNA模板和2×10<'-5>ng/μl的PCV-2和PPV單鏈DNA模板。經對50份自然感染病豬樣品檢測結果表明，該三重PCR檢測結果與單一PCR．檢測結果符合率達到96％，試驗結果提示，建立的三重PCR檢測方法可用于3種DNA病毒的同時檢測，具有快速、準確的特點，有臨床應用前景。 采用建立的PCR檢測系統(tǒng)