前交叉韌帶組織工程種子細胞的體外研究.pdf

1、前交叉韌帶是膝關節(jié)內重要穩(wěn)定結構，損傷后缺乏自我愈合能力，通常需要利用移植物關節(jié)鏡下重建前交叉韌帶。各種移植物都有其局限性。利用組織工程方法構建有望克服目前移植物的問題。種子細胞、生物材料和組織構建是組織工程的三個基本要素。種子細胞的選擇成為韌帶組織工程的研究課題之一。本實驗從研究ACL內部組織學和細胞學開始，比較四種成熟機體細胞（前交叉韌帶細胞、皮膚成纖維細胞、跟腱細胞、內側副韌帶細胞），從中篩選較為理想的種子細胞，最后體外誘導分化骨

2、髓基質干細胞,探索誘導條件，為組織工程化ACL的種子細胞提供一種干細胞來源。 第一部分：前交叉韌帶組織學和細胞學觀察 目的：了解前交叉韌帶近側、中段、遠側區(qū)組織學特性，了解前交叉韌帶細胞的體外分離培養(yǎng)方法及其生物學特性，為韌帶組織工程種子細胞的研究打下基礎。 方法：取兔ACL12條，進行HE、甲苯胺藍、天狼猩紅染色，對近、中、遠三段進行比較。用組織塊法、酶消化法分離培養(yǎng)細胞，對不同代次細胞進行相差顯微鏡觀察、生長

3、曲線測定、Ⅰ型膠原免疫組化染色。 結果：HE染色見ACL中段細胞核呈特征明顯的短桿狀，細胞呈長梭形，近側和遠側區(qū)核呈圓形或卵圓形，細胞呈圓形，所有細胞均沿膠原束方向排列；甲苯胺藍染色中段呈陰性，近側和遠側為陽性；天狼猩紅染色近側、中段、遠側膠原Ⅰ、Ⅲ均為陽性。酶消化法分離培養(yǎng)貼壁快，細胞傳代五次后，細胞的生長速度、Ⅰ膠原分泌量明顯減低。 結論：兔前交叉韌帶近側區(qū)、中段、遠側區(qū)在組織學上不同。酶消化法分離培養(yǎng)細胞更適合于組

4、織工程，前交叉韌帶細胞第一～第四代可作為構建組織工程化前交叉韌帶的種子細胞，但取材困難，來源有限。 第二部分：前交叉韌帶組織工程種子細胞篩選的初步研究 目的：為組織工程方法構建前交叉韌帶篩選較為理想的種子細胞。 方法：體外分離培養(yǎng)兔前交叉韌帶（ACL）、內側副韌帶（MCL）、跟腱（AT）、皮膚成纖維細胞（SK），比較四種細胞的生長狀態(tài)、增殖活性、Ⅰ、Ⅲ型膠原分泌量。 結果：在含體積分數10％小牛血清的DM

5、EM培養(yǎng)液中，四種細胞生長良好、細胞形態(tài)相似、但以SK細胞生長最快，AT細胞次之，MCL細胞和ACL細胞生長最慢。SK、MCL、ACL細胞均分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原，AT細胞只分泌Ⅰ型膠原。SK細胞Ⅰ型膠原染色密度較MCL、ACL 、AT細胞高，SK細胞Ⅲ型膠原染色密度較MCL、ACL細胞高。 結論：SK細胞增殖活性高，分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原多，取材簡便，是較為理想的前交叉韌帶組織工程種子細胞。 第三部分：EGF在體外誘導骨髓基質干細

6、胞增殖分化為成纖維細胞的實驗研究 目的：研究不同濃度表皮生長因子在體外誘導兔骨髓基質干細胞向成纖維細胞增殖分化的作用，為韌帶組織工程提供種子細胞來源。 方法：以2ng/ml、20ng/mlEGF 對體外培養(yǎng)的BMSCs進行誘導分化培養(yǎng)，進行相差顯微鏡觀察細胞生長，MTT 檢測細胞增殖，免疫組化半定量細胞分化。 結果：誘導后7d、14d時，2ng/ml、20ng/mlEGF 誘導組呈現更均一的纖維細胞樣帶有長突起的

7、紡錘形細胞，呈束狀排列，比對照組具有更高的細胞密度；2ng/ml、20ng/mlEGF 誘導組在7、14d 細胞增殖均比對照組快；第10d 時，2ng/ml、20ng/mlEGF 誘導組、對照組膠原Ⅰ、Ⅲ染色均為陽性，但誘導組有更高的染色密度，誘導組之間無差別；2ng/ml、20ng/mlEGF 誘導組、對照組膠原Ⅱ染色陰性。 結論： EGF 有能力刺激細胞的增殖，并且能刺激符合肌腱和韌帶組織工程的細胞外基質的表達，但濃度2ng