基于TGF-β-Smad-ERK信號轉導通路的補陽還五湯拮抗肺纖維化機制研究.pdf

1、肺纖維化(pulmonary fibrosis, PF)屬于纖維增殖性疾病的范疇，是多種原因所致的間質性肺疾病(interstitial lung disease, ILD)共有的病理基礎過程，其病變主要累及肺間質，也可累及肺泡上皮細胞及肺血管，以肺成纖維細胞的異常增生和膠原蛋白為主的細胞外基質過度沉積為主要表現(xiàn)，至今發(fā)病機制不明，且沒有理想的治療方法。由于大多數(shù)肺部疾病最終轉歸為肺纖維化，并且隨著污染、環(huán)境惡化等因素，肺纖維化當今在全

2、球的發(fā)病率呈不斷上升的趨勢，已成為嚴峻的健康問題，因此對肺纖維化發(fā)生機制和有效藥物的研究具有非常重要的科學價值。研究顯示轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是致纖維化關鍵性的細胞因子，Smads通路介導的致纖維化作用與 ERK通路介導的促增殖作用在纖維化的發(fā)生發(fā)展中均是不可或缺的。肺纖維化屬中醫(yī)“肺痿”、“肺痹”等范疇，其病機為氣虛血瘀，故益氣活血法是治療肺纖維化的基本大法。我們

3、在前期對益氣活血法干預肺纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)：補陽還五湯具有抑制實驗性肺纖維化大鼠肺組織 TGF-β1的過度表達，減少肺組織中羥脯氨酸含量，降低肺泡巨噬細胞腫瘤壞死因子含量的作用，提示補陽還五湯干預肺纖維化的作用可能與其調控TGF-β/Smad/ERK信號通路有關?；诖?，我們以TGF-β/Smad/ERK信號通路為切入點，將研究靶點精準定位于肺纖維化形成的關鍵病理環(huán)節(jié)，探討補陽還五湯拮抗肺纖維化的可能作用機制，以期拓展補陽還五湯的適用范

4、圍，為臨床研究奠定基礎。
　　本研究以博萊霉素(bleomycetin,BLM)誘導肺纖維化大鼠模型為評價載體，從病理學、分子生物學角度探討補陽還五湯調控TGF-β/Smad/ERK信號通路的作用機制。實驗共分為四部分：
　　1.補陽還五湯對博萊霉素所致肺纖維化大鼠肺指數(shù)及肺組織形態(tài)學的影響
　　建立肺纖維化大鼠模型，通過補陽還五湯干預后，動態(tài)觀察模型大鼠的一般情況（精神、攝食、毛色、活動、體重等）、肺指數(shù)，采集肺組織

5、行HE染色和Masson染色，分析病肺組織肺泡炎及肺纖維化程度，探討補陽還五湯抗肺纖維化的作用。
　　結果：①一般情況：假手術組大鼠皮毛光澤，行動靈活，反應敏捷，食量正常；模型組大鼠食欲下降，毛發(fā)凌亂、稀疏、部分脫毛嚴重，對外界刺激反應慢、行動遲緩，體重增長緩慢；其余各給藥組隨實驗時間的推進，活動減少、食量下降等癥狀有不同程度的改善，體重逐漸增加；②肺指數(shù)：與假手術相比，模型組大鼠各時間點肺指數(shù)增加明顯(p<0.01)；與模型組比

6、較，各給藥組大鼠肺指數(shù)有不同程度的下降(p<0.01)；與強的松對照組相比，補陽還五湯中劑量組第14d、28d、低劑量組第28d肺指數(shù)降低較明顯(p<0.05)；高劑量組三個時間點肺指數(shù)均高于強的松對照組，但與同期模型組相比仍較有明顯的降低。③病理形態(tài)學：與假手術相比，模型組及各給藥組大鼠可見肺泡結構有不同程度的破壞，肺間質增生，有炎細胞浸潤和膠原纖維增生形成；與模型組相比，給藥組各時間點的肺泡炎和肺纖維化程度均有不同程度的改善(p<0

7、.01)；其中補陽還五湯中劑量組在中后期降低肺泡炎及纖維化程度方面明顯優(yōu)于同期強的松對照組(p<0.05)。
　　結論：博萊霉素誘導肺纖維化大鼠模型制備成功；補陽還五湯能夠較好地控制模型大鼠肺指數(shù)的增長，抑制早期的肺泡炎和中后期的肺纖維化。
　　2.補陽還五湯對博萊霉素所致肺纖維化大鼠血清纖維化指標PCIII、IV-C、HA、LN含量的影響
　　建立肺纖維化大鼠模型，通過補陽還五湯干預后，采用放免法檢測各組大鼠血清纖維

8、化指標PCIII、IV-C、HA、LN的含量，驗證補陽還五湯對肺纖維化的治療作用。
　　結果：①與假手術組相比，其它各組大鼠血清PCIII、IV-C、HA、LN的含量均逐漸升高，以模型組最為明顯(p<0.01)；②與模型組相比，各給藥組大鼠血清PCIII、IV-C、HA、LN含量均有不同程度降低(p<0.01)；③與強的松對照組相比，補陽還五湯中劑量組第14d、28d以及補陽還五湯低劑量組第28d時，PCIII、IV-C、HA、L

9、N含量下降明顯(p<0.05)。
　　結論：經(jīng)補陽還五湯治療后的模型大鼠血清纖維化指標含量有所下降，提示補陽還五湯可以有效抑制病肺組織中膠原纖維的增殖以及細胞外基質的沉積，起到較好的抗肺纖維化作用。
　　3.補陽還五湯調控肺纖維化TGF-β1/Smad通路機制研究
　　建立肺纖維化大鼠模型，通過補陽還五湯干預后，采用免疫組化染色法(S-P法)檢測不同時間點各組大鼠肺組織Col-I、TβRI、TβRII、Smad3、Sm

10、ad7的表達，逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR法)檢測肺組織TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA的含量，探討補陽還五湯通過調控TGF-β1/Smad信號通路干預肺纖維化的作用機制。
　　結果：①與假手術組相比，模型組大鼠肺組織Col-I、TβRI、TβRII、TGF-β1mRNA、Smad3mRNA表達水平明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)；Smad7、Smad7mRNA表達下降(p<0.01)；②與模型組相比，

11、各給藥組Col-I、TβRI、TβRII、TGF-β1mRNA、Smad3mRNA有不同程度的下降(p<0.01 or p<0.05)；Smad7、Smad7mRNA表達增高(p<0.01 or p<0.05)；③與強的松對照組相比，補陽還五湯中、低劑量組肺內Col-I、TβRI、TβRII、TGF-β1mRNA、Smad3mRNA的表達降低(p<0.01 or p<0.05)，Smad7、Smad7mRNA的表達增高(p<0.05)。

12、
　　結論：補陽還五湯能夠有效抑制TGF-β1/Smad信號通路中發(fā)揮效應的Col-I、TβRI、TβRII、TGF-β1、Smad3等因子的高表達，同時促進該通路中發(fā)揮負性調控效應的Smad7達增加，證實了補陽還五湯能夠發(fā)揮較好的抗肺纖維化作用與其調控TGF-β1/Smad信號通路有關。
　　4.補陽還五湯調控肺纖維化TGF-β1/ERK通路機制研究
　　建立肺纖維化大鼠模型，通過補陽還五湯干預后，采用Western

13、 blot法檢測不同時間點各組大鼠肺組織TGF-β1、ERK1/2、p-ERK的表達，探討補陽還五湯通過調控TGF-β1/ERK通路干預肺纖維化的作用機制。
　　結果：①與假手術組相比，模型組大鼠肺組織TGF-β1、ERK1/2、p-ERK表達水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)；②與模型組相比，各給藥組TGF-β1、ERK1/2、p-ERK有不同程度的下降，差異明顯(p<0.01 or p<0.05)；③與強的松對照組

14、相比，補陽還五湯中劑量組在第14d、28d，低劑量組在第28d時TGF-β1、ERK1/2、p-ERK的表達明顯降低(p<0.05)。
　　結論：補陽還五湯可以有效抑制病肺組織TGF-β1、ERK1/2、p-ERK表達上調，提示補陽還五湯能夠較好的調控肺纖維化中TGF-β1介導的ERK通路，進而抑制其產生的促增殖作用。
　　綜上所述，本研究采用博萊霉素氣管滴注經(jīng)典造模方法制備大鼠肺纖維化模型，以TGF-β/Smad/ERK信

15、號通路為切入點，采用現(xiàn)代分子生物學等研究技術和手段，從動物水平探討補陽還五湯干預肺纖維化的可能作用機制。研究結果表明：補陽還五湯可以有效改善模型大鼠肺泡炎癥及肺纖維化程度，降低血清PCIII、IV-C、HA、LN含量，抑制TβRI、TβRII、Smad3、CollagenI、TGF-β1mRNA、Smad3mRNA、ERK1/2、p-ERK蛋白在病肺組織中的過度表達，促進Smad7以及Smad7mRNA的活性，提示補陽還五湯可以有效調控