人工細胞外支架：50μm細絲鈦網三維結構對兔骨髓間充質干細胞成骨作用的實驗研究.pdf

1、骨質缺損仍是目前導致患者功能喪失及生活質量降低的重要問題。臨床上最為常用的修復方法仍是自體骨移植，然而這種方法卻存在著一定的弊端。尋求更為合適的骨缺損修復方法成為當今的研究熱點，這就需要多學科的共同努力。組織工程的興起為骨缺損的修復提供了一條廣闊的途徑。上世紀80年代發(fā)現了具有多項分化潛能的間充質干細胞，使其成為理想的骨組織工程種子細胞，同時支架材料的研究也逐漸從二維結構向三維結構轉變。
　　本實驗提出了具有三維結構特性的鈦網(T

2、itanium web，TW)，擬通過體外成功培養(yǎng)兔骨髓間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，觀察鈦網對兔骨髓MSCs的成骨作用。以便了解該材料作為骨組織工程支架材料的特性。
　　材料和方法:
　　1.本實驗所采用的三維鈦網是由日本Kuboki教授設計、HI-LEX公司提供的。材料特性為20-100μm直徑的鈦纖維束編織而成，內部形狀為類蜂巢狀結構，孔的平均直徑為50-250μm，孔隙率達6

3、0-87％(圖1)。選取普通級新西蘭大白兔，4～6周齡。采用20％烏拉坦按以5 ml/kg體重的劑量麻醉新西蘭大白兔，無菌條件下取出大白兔的股骨，并移入超凈工作臺。沿股骨干中間剪開，將髓腔內容物反復沖出。采用密度梯度離心與全骨髓貼壁培養(yǎng)相結合的方法將兔骨髓間充質干細胞從骨髓(Bone marrow, BM)中分離出來。
　　2.兔骨髓MSCs的鑒定:倒置顯微鏡下觀察細胞的生長特點，選取生長特性穩(wěn)定的第三代細胞，待其達80％融合時，

4、分別換用成骨誘導培養(yǎng)基及成脂肪誘導培養(yǎng)基。2周后通過堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)染色、茜素紅染色及油紅O染色鑒定細胞是否已發(fā)生定向分化。判斷體外培養(yǎng)的細胞是否為兔骨髓MSCs。
　　3.將已成功獲得的兔骨髓MSCs與細絲鈦網共同培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞能否順利生長在鈦網上。
　　4.由于鈦網的不透光性，倒置顯微鏡并不能準確觀察細胞在鈦網上的生長特點，故采用掃描電鏡(Scanning elec

5、tron microscope，SEM)來觀察其生長特點。
　　5.鈦網與兔骨髓MSCs共同培養(yǎng)后，取出鈦網，采用ALP染色觀察分析鈦網周圍與其有接觸的兔骨髓MSCs的成骨特性。
　　結果:
　　1.原代兔骨髓MSCs培養(yǎng)早期可見少數單個核細胞貼壁，形態(tài)細胞呈多角形。6-10d后細胞增殖速度加快并且發(fā)生細胞間的融合，細胞形態(tài)表現為成纖維細胞樣的長梭形，且細胞形態(tài)逐漸均一，融合后表現為魚肉狀。
　　2.對原代培養(yǎng)的

6、兔骨髓MSCs進行成骨及成脂誘導，對于成骨誘導組2周后行茜素紅染色及ALP染色，可見胞漿中有礦化結節(jié)及較多的棕紅色顆粒。對于成脂誘導組，顯微鏡下觀察細胞體積變大，核周可見空泡樣結構。進行油紅O染色，可見細胞內有紅色脂滴，有的融合成大脂滴，有的成串珠樣排列。
　　3.將鈦網與兔骨髓MSCs共同培養(yǎng)后在倒置顯微鏡下觀察細胞及鈦網的關系時，由于鈦網的不透光性，偶可見鈦網支架邊上有細胞生長。通過SEM，可以觀察到兔骨髓MSCs能良好的生長

7、在鈦網上，細胞與材料復合培養(yǎng)1周后，細胞已在材料表面和孔隙內均可黏附和生長，但數量較少;隨著時間的延長，細胞進一步生長、分化和增殖。2周后大量細胞粘附在鈦網上，細胞數量明顯多于1周時，細胞形態(tài)呈長梭形，細胞間相互交錯生長，呈網狀覆蓋材料的表面，同時可見細胞分泌的基質也沉積于細胞周圍及支架表面。
　　4.鈦網與兔骨髓間充質干細胞共同培養(yǎng)2周后，取出鈦網，將位于孔板底部的細胞進行ALP染色，見與鈦網接觸想細胞胞漿內出現較多的棕紅色顆粒