基于SERS技術(shù)建立新城疫病毒檢測(cè)方法.pdf

1、新城疫（Newcastle Disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）引起的一種高度接觸性的烈性傳染病。禽類(lèi)感染NDV后以呼吸道、消化道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷為主要特征。該病呈世界性分布，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。除了強(qiáng)制免疫，對(duì)新城疫的定期監(jiān)測(cè)是防控該病的另一重要方面，由此也產(chǎn)生了大量的檢測(cè)工作。傳統(tǒng)的NDV檢測(cè)技術(shù)包括血清學(xué)技術(shù)如HA-HI、ELISA，分子生物技術(shù)如RT-PCR等

2、。然而這些技術(shù)存在著一些不足的地方，如實(shí)驗(yàn)操作步驟較為冗雜、需時(shí)較長(zhǎng)、價(jià)格昂貴、非特異性因素的干擾等。因此亟待建立一種操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏、無(wú)損的高通量檢測(cè)方法。表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)（Surface Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）可使分子的拉曼信號(hào)增強(qiáng)1014~1015倍，是一種無(wú)損、快速、特異、靈敏的檢測(cè)技術(shù)，可以提供明確的分子結(jié)構(gòu)和物質(zhì)成分信息，為建立病毒檢測(cè)方法提供了新的思路。本文結(jié)合拉曼光譜技

3、術(shù)和免疫學(xué)，首次建立SERS新城疫病毒的檢測(cè)方法。
　　本研究基于抗原抗體特異性識(shí)別并結(jié)合的原理，通過(guò)拉曼標(biāo)記的免疫探針溶液檢測(cè)新城疫病毒。將新城疫病毒固定在硝酸纖維素膜(Nitrocellulose membranes，NC membranes)上，制備antibody-DSNB-AuNP免疫探針捕捉NC膜上固定的抗原，形成“抗原-免疫探針”半三文治結(jié)構(gòu)復(fù)合物。通過(guò)對(duì)免疫探針中υs(NO2)拉曼峰的識(shí)別，實(shí)現(xiàn)對(duì)NDV的檢測(cè)。本研

4、究探索了試驗(yàn)實(shí)施的條件如積分時(shí)間、功率、納米金顆粒規(guī)格、封閉時(shí)間和探針?lè)跤龝r(shí)間。測(cè)定優(yōu)化條件后檢測(cè)方法的特異性、靈敏度，并與常規(guī)檢測(cè)NDV方法的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)進(jìn)行比較。最后評(píng)估本研究建立的SERS檢測(cè)法的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)。
　　本研究結(jié)果表明，運(yùn)用SERS檢測(cè)NDV的LOD(Limit of detection)值為2 logTCID50，在2 logTCID50~7 logTCID50范圍內(nèi)，υs(NO2)的強(qiáng)度與病毒滴度成線(xiàn)性相關(guān)，線(xiàn)性

5、回歸符合y=397.94x-808.97，相關(guān)系數(shù)R2為0.9859。意味著SERS檢測(cè)法能夠在一定范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)NDV定性及定量的測(cè)定。滴度為7 logTCID50~2 logTCID50的病毒液，其拉曼測(cè)試υs(NO2)的強(qiáng)度值，同一滴度組內(nèi)CV（變異系數(shù)，Coefficient of Variation）值分別為5.16％、4.97%、6.40%、11.17%、19.24%、62.23%。應(yīng)用本文建立的SERS檢測(cè)法對(duì)不同基因型的新城

6、疫毒株進(jìn)行檢測(cè)，均診斷為NDV陽(yáng)性；而對(duì)其他禽類(lèi)病毒和細(xì)菌的診斷結(jié)果為NDV陰性。整個(gè)診斷用時(shí)少于2 h。上述數(shù)據(jù)說(shuō)明本試驗(yàn)具有較好的穩(wěn)定性、靈敏度和特異性。本試驗(yàn)條件優(yōu)化結(jié)果為：積分時(shí)間4 s、納米金顆粒（60±5）nm、測(cè)試功率40 mW、封閉時(shí)間45 min、探針?lè)跤龝r(shí)間60 min。SERS檢測(cè)法操作簡(jiǎn)便、快速，減少了篩查新城疫病毒的工作量。這是國(guó)內(nèi)外首次應(yīng)用SERS技術(shù)檢測(cè)新城疫病毒的研究，填補(bǔ)了SERS技術(shù)檢測(cè)新城疫病毒的空