骨髓間充質干細胞穿過血腦屏障機制的研究.pdf

1、目的： 骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種存在于骨髓中的非造血干細胞，來自中胚層。它除了能分化為骨細胞，軟骨細胞<'[1]>，心肌細胞<'[2]>等中胚層細胞，還能跨胚層分化為神經(jīng)元和星形膠質細胞<'[3]>。它移植入腦可以遷移至受損腦區(qū)<'[4]>，通過分化為神經(jīng)細胞<'[5]>，促進神經(jīng)前體細胞的分化<'[6]>，分泌細胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子<'[7]>等多種機制促進腦損傷后功能的

2、恢復<'[8]>。又因其不表達MSCⅡ類分子<'[9]>，且有免疫抑制作用，并能夠穩(wěn)定的表達外源性基因<'[10]>成為治療腦卒中等累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的種子細胞。血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)是一道天然的生理屏障，它將中樞神經(jīng)系統(tǒng)與其它的系統(tǒng)隔離開。組成血腦屏障的內皮細胞是特化的細胞，它們之間形成緊密連接，成為外周細胞入腦的主要障礙。采用側腦室或腦實質內定位注射MSCs的方法操作技術要求高，并有引起腦水腫及

3、阻塞腦脊液循環(huán)系統(tǒng)等弊病，故其臨床應用受限。后來人們發(fā)現(xiàn)經(jīng)尾靜脈向腦梗死的大鼠注入MSCs,移植細胞可穿過BBB，且有定向遷移至腦損傷的趨勢<'[11]>。但是到目前為止，MSCs穿過血腦屏障的機制，尤其是MSCs穿過腦微血管內皮屏障的機制，還很少有人研究。本研究旨在探索MSCs與腦微血管內皮細胞的相互作用，從而為將來體外調控MSCs高效特異穿過血腦屏障入腦發(fā)揮其修復神經(jīng)損傷作用提供試驗依據(jù)和理論基礎。 方法： 1 MS

4、Cs的分離培養(yǎng)和鑒定1．1在無菌條件下取Wistar大鼠股骨和脛骨骨髓細胞，體外分離，培養(yǎng)和擴增。 1．2免疫細胞化學染色法鑒定MSCs表面標志CD45和CD90的表達情況。 2 免疫熒光染色檢測MSCs作用于HBMECs單層引起HBMECs的緊密連接蛋白ZO-1的變化。 3 Phalloidin染色方法檢測MSCs作用于HBMECs單層引起HBMECs的F-actin的變化。 4 MSCs跨內皮遷移試驗

5、4．1 MSCs穿過血腦屏障體外模型的建立。 4．2 利用已建立的模型研究PKC，PI3K/Akt，Rho/ROCK信號通路對MSCs穿過HBMECs的能力影響。 5 Phalloidin染色方法檢測PKC，P13K/Akt，Rho/ROCK信號通路對MSCs的F-actin的影響。 6 細胞黏附試驗檢測Rho/ROCK通路對MSCs黏附與HBMECs能力的影響。 7 利用Transwell檢測Rho/R

6、OCK通路對MSCs遷移的影響。 8 Western Blotting法檢測MSCs與HBMECs作用后引起HBMECs緊密連接蛋白Oecludin的變化。 9 統(tǒng)計學分析 結果 1 大鼠骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定 1．1 分離純化后的MSCs程梭形，在培養(yǎng)皿中呈現(xiàn)規(guī)律的漩渦狀排列 1．2 免疫細胞化學檢測結果顯示，所分離細胞為CD90陽性，CD45陰性，符合MSCs特征 2

7、 MSCs作用于HBMECs單層于15分鐘即可黏附于HBMECs，并逐漸伸出片足和較長的偽足；MSCs能夠引起HBMECs的緊密連接的開放；MSCs能夠引起HBMECs細胞骨架蛋白F-actin隨著作用時間的延長的解聚 3 建立MSC穿過腦微血管內皮細胞單層的模型，并利用該模型發(fā)現(xiàn)了抑制MSCs的Rho/ROCK通路能夠促進MSCs穿過HBMECs單層。 4 抑制MSCs的Rho/ROCK通路能夠引起其細胞形態(tài)學的改變以

8、及F-actin的解聚。 5 抑制MSCs的Rho/ROCK通路不影響MSCs與HBMECs的黏附。 6 抑制MSCs的Rho/ROCK通路能夠促進MSCs的遷移。 7 抑制MSCs的Rho/ROCK通路能夠促進MSCs在穿過HBMECs單層過程中引起HBMECs緊密連接的開放。 結論： 本研究發(fā)現(xiàn)抑制MSCs的Rho/ROCK通路能夠增強MSCs的遷移能力，促進MSCs穿過血腦屏障，而且這種促進