抗人血小板糖蛋白IIb-IIIa人-鼠嵌合抗體的研制.pdf

1、該課題的目的是從該室已經(jīng)制備的抗人血小板GPⅡb/Ⅲa單克隆抗體中篩選出與血小板特異性結合最強且抑制血小板聚集最顯著的一種抗體P140,進行人源化改構,在保留鼠源可變區(qū)的同時,引入人源恒定區(qū),制備抗人血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的人-鼠嵌合抗體.以期成為用于臨床治療心腦血管疾病以及預防PCI術后"再狹窄"的有效藥物.通過間接免疫熒光試驗和血小板聚集抑制試驗,選取單克隆抗體P140,并從該抗體的雜交瘤細胞株(P140)中提取總RNA,通過反轉錄

2、PCR得到抗體輕鏈基因和重鏈Fd段基因,以特定位點分別插入噬菌體抗體表達載體p3MH上,構建原核表達重組質粒p3MH/P140 κ-Fd,并在XLI-Blue菌中進行了原核表達.ELISA鑒定結果表明,表達上清中含有可溶性Fab抗體,并且能特異性地識別人血小板.進而對表達產(chǎn)物進行了親合層析純化.SDS-PAGE蛋白電泳、ELISA和Western blot的檢測結果證明,P140Fab抗體的分子量約47kD,是鼠源性的Fab抗體,與人血

3、小板能特異性結合,體外ADP誘導的血小板聚集試驗證明,P140Fab抗體能明顯抑制血小板的聚集,并且具有劑量抑制效應.用RACE(cDNA末端的快速擴增)的方法,獲得了完整的P140抗體重、輕鏈可變區(qū)基因,分別連接于帶有前導序列的真核表達載體VH、V κ上,分別構建了重、輕鏈嵌合抗體的真核表達載體VH/CP140和V κ/CP140,共轉染到CHO細胞中,進行瞬時表達.RT-PCR和ELISA檢測證明,轉染后宿主細胞有人-鼠嵌合抗體基因

4、的轉錄,表達上清中含有人-鼠嵌合抗體CP140.隨后將包括前導序列在內(nèi)的鼠單抗P140可變區(qū)基因分別連接于不含前導序列真核表達載體PWS3上,構建真核重組表達載體PWS3-P140,轉染CHO細胞,ELISA檢測結果證明,表達上清中含有能與血小板特異性結合的人-鼠嵌和抗體,而且表達量明顯提高.結論:成功研制了一種新的功能性抗人血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的Fab抗體(P140Fab);成功構建了抗人血小板嵌合抗體的真核表達載體并在CHO細胞中