中國男性不育患者CFTR基因突變檢測及其意義.pdf

1、前言
　　人類生存繁衍的基礎是生殖，生殖健康是人類健康的核心和社會文明進步的標志。不生育是影響男女雙方和家庭的全球性問題。目前全球大約有15％的夫婦受到不育的困擾，其中男方因素所致不少于50％，而他們當中一半以上的患者病因不明。大量遺傳學與分子生物學的研究表明，除外傷以外，人類所有疾病幾乎均與基因有關。隨著人類基因組計劃項目的完成，人類基因的研究進入后基因組時代，其科研成果迅速應用于疾病的預防、診斷和治療。導致特發(fā)性無精子癥及嚴重

2、少弱精子癥的病因相當復雜，推測其中最主要的因素是遺傳學改變。目前研究證實基因異常與不明原因的嚴重少精子和無精子密切相關，包括Y染色體微缺失、特定基因的突變或特定基因的多態(tài)性改變。為了從根本上實現(xiàn)對男性不育的診療，我們選定男性不育癥相關基因為主要研究方向。目前已知Y染色體微缺失可導致特發(fā)性無精子癥或嚴重少弱精子癥;CFTR基因突變與先天性雙側輸精管缺如(CBAVD)密切相關。先天性雙側輸精管缺如患者占到男性不育門診無精子癥病例的1-2％以

3、上，占到梗阻性無精子癥的25％?；颊叱杂X精液量少之外多無其他臨床表現(xiàn)，彩超多提示附睪網(wǎng)格狀回聲、附睪發(fā)育不良、雙側精囊腺發(fā)育不良，少數(shù)病例合并腎臟發(fā)育畸形、腎缺如。國外做了大量的CFTR基因突變與先天性雙側輸精管缺如關系的研究。發(fā)現(xiàn)已知的CFTR基因突變1900多種，并且還在不斷增加。發(fā)現(xiàn)先天性雙側輸精管缺如的患者中75％的病例至少存在1個CFTR基因突變。其中F508del、5T和R117H是最常見的突變。但是研究顯示，F(xiàn)508de

4、l這種高加索人最常見的突變在亞洲人中卻很少出現(xiàn)。不同地區(qū)、不同種族之間，突變發(fā)生的情況差異很大。目前尚缺乏在中國人群中的報道，中國生育力正常人群和男性不育癥患者CFTR基因突變情況尚不清楚。本研究以中國生育力正常男性和男性不育癥患者（先天性雙側輸精管缺如和非梗阻性無精子癥患者）為研究對象，檢測其CFTR基因M470V、TG-repeats、ploy-T以及CFTR基因全外顯子突變情況，以明確我國生育力正常男性和男性不育癥患者CFTR基因

5、突變和多態(tài)性分布情況及其臨床意義，為遺傳咨詢和進一步發(fā)現(xiàn)新的致病基因打下基礎。
　　材料和方法
　　一、實驗材料
　　2008年至2012年間在中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院和上海醫(yī)科大學附屬仁濟醫(yī)院就診的95例先天性雙側輸精管缺如患者，入選標準:①除原發(fā)不育外無其他囊性纖維化疾病癥狀;②體檢雙側睪丸體積正常，未觸及雙側輸精管;③三次精液常規(guī)檢查（離心沉淀鏡檢）均未見精子，排精后尿沉淀亦未見精子（排除逆行射精和不射精），精液

6、PH值呈酸性，精漿果糖及糖苷酶定量分析顯著低于正常;④生殖激素檢測及染色體檢查均正常;⑤附睪或睪丸穿刺取到精子。同期在中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院就診的67例臨床診斷明確的非梗阻性無精子癥患者，入選標準:①原發(fā)不育病史;②查體雙側睪丸體積正?；蛐∮谡＃ㄐ∮?2ml）;③三次精液常規(guī)檢查（離心沉淀鏡檢）均未見精子，排精后尿沉淀亦未見精子（排除逆行射精和不射精），精液PH值正常，精漿果糖及糖苷酶定量分析正常;④生殖激素檢測FSH正?；蛏撸ù?/p>

7、于12mU/ml），染色體檢查正常;⑤睪丸活檢病理Johnsen積分法評分2-8分。同時收集同期135例因女方因素擬行試管嬰兒、精液常規(guī)檢查正常的生育力正常男性作為對照。以上病例經(jīng)知情同意后采集外周血2ml，EDTA抗凝，使用QIAGENBioRobotEZ1全自動核酸提取工作站磁珠法抽提DNA，-20℃冰箱保存。
　　二、實驗方法
　　1、使用Real-timePCR技術通過CyclingProbe法檢測基因組DNA標本C

8、FTR基因外顯子10上M470V多態(tài)性分布情況，比較生育力正常男性、先天性雙側輸精管缺如患者以及非梗阻性無精子癥患者3組之間M470V基因型及等位基因的差異。
　　2、參考網(wǎng)站NCBIprime-blast，應用軟件Primer5.0自行設計引物，對CFTR基因內含子8的目的基因片段進行擴增、測序，從DNA測序結果直接分析TG-repeats、ploy-T多態(tài)性分布情況，比較生育力正常男性和先天性雙側輸精管缺如患者之間TG-rep

9、eats、ploy-T多態(tài)性分布差異。并與此前論文一的M470V檢測數(shù)據(jù)相結合，分析TG-repeats、ploy-T與M470V之間的關系。
　　3、參考文獻及網(wǎng)站NCBIprime-blast，應用軟件Primer5.0自行設計CFTR基因全外顯子擴增引物，對CFTR基因全外顯子進行測序。測序結果使用Chromasv1.62軟件分析并結合人工讀圖，參考http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/序

10、列，在網(wǎng)站http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/在線比對，對新發(fā)現(xiàn)的突變位點在網(wǎng)站https://mutalyzer.nl/positionConverter在線分析。
　　結果
　　1、生育力正常男性、先天性雙側輸精管缺如患者以及非梗阻性無精子癥患者3組之間M470V基因型及等位基因分布的頻率無顯著性差異(P＞0.05)。MV基因型為最常見的基因型，在生育力正常男性人群中的基因型頻率為0.4296，其

11、次為VV基因型，基因型頻率為0.3704，最少見的為MM基因型，基因型頻率為0.2。MM、MV、VV基因型在生育力正常的男性人群中的分布符合哈迪-溫伯格平衡定律(P＞0.05)。V470等位基因為生育力正常的男性中常見的等位基因，等位基因頻率為0.5852，M470等位基因與V470等位基因在生育能力正常的男性人群中的分布比例約為0.7∶1。
　　2、先天性雙側輸精管缺如患者中T5等位基因的分布頻率為0.3202，而生育力正常男性

12、中為0.0340。生育力正常男性與先天性雙側輸精管缺如患者T5等位基因的分布頻率有統(tǒng)計學差異(P＜0.001)，T5與患者罹患先天性雙側輸精管缺如有關。所有包含TG13T5單倍體基因型和TG12T5純合體個體均表現(xiàn)為先天性雙側輸精管缺如。TG12為生育力正常男性人群中最常見的等位基因頻率。TG12T7為生育力正常男性中最常見的單倍體基因型。TG12T5-V470與患者罹患先天性雙側輸精管缺如有關。
　　3、對9例先天性雙側輸精管缺

13、如患者CFTR基因進行全外顯子測序分析，在外顯子區(qū)新發(fā)現(xiàn)4種不同于國外已知突變類型的新型突變，均為錯義突變，并經(jīng)網(wǎng)站http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/上報確認。
　　結論
　　1、CFTR基因M470V多態(tài)性分布本身與中國男性不育癥患者罹患先天性雙側輸精管缺如或非梗阻性無精子癥無關。在生育力正常男性中M470與V470在生育力正常男性人群中分布比例約為0.7∶1，較歐洲人偏低。MM、M

14、V、VV基因型在中國生育力正常男性人群中的分布符合哈迪-溫伯格平衡定律。
　　2、中國CFTR基因T5多態(tài)性改變與患者罹患先天性雙側輸精管缺如有關。所有包含TG13T5單倍體基因型和TG12T5純合體個體均表現(xiàn)為先天性雙側輸精管缺如。TG13及TG12或與T5協(xié)同作用導致患者罹患先天性雙側輸精管缺如。TG12T5-V470單倍體基因型可能與患者罹患CBAVD有關。
　　3、中國先天性雙側輸精管缺如患者CFTR基因外顯子區(qū)存在