全反式維甲酸、亞砷酸對白血病NB4細胞CD44變異體表達的影響.pdf

1、目的:本研究采用ATRA、As2O3作用于人APL細胞株NB4細胞,通過光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)、MTT法觀察細胞生長抑制狀況、流式細胞術檢測細胞分化及凋亡、并應用RO-PCR法檢測ATRA、As2O3作用前后NB4細胞CD44v3、CD44v6及CD44v10及PML/RARα mRNA表達水平的變化。旨在探討誘導APL細胞分化或凋亡過程中不同CD44v分子和PML/RARα表達的變化,及二者的相互關系,為CD44v作為白血病診斷、療效

2、判斷及預后指標提供理論依據。
　　 方法:體外培養(yǎng)人APL細胞株NB4細胞,分別用ATRA、As2O3、ATRA+As2O3進行干預,應用MTT比色法檢測細胞生長；用流式細胞術分析以上藥物對細胞分化的影響；AnnexinV-FITC/PI雙標法檢測上述藥物對NB4細胞凋亡的影響；應用RQ-PCR法檢測細胞中PML/RARμ、CD44v3、CD44v6、CD44v10mRNA的表達水平變化。所得結果運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包處

3、理,以μ=0.05為顯著性檢驗水準。
　　 結果:
　　 1 ATRA、As2O3作用下NB4細胞的形態(tài)學改變:NB4細胞株具有急性早幼粒白血病細胞的典型形態(tài),胞漿充滿顆粒,核膜略凹陷,有空泡。Wright's-Giemsa染色光鏡下觀察:經ATRA作用后NB4細胞體積變小、核漿比例縮小、染色質變粗糙、核仁消失；核形態(tài)不規(guī)則,呈腎形、桿狀及分葉核。As2O3作用于NB4細胞后表現為細胞體積縮小,細胞膜完整,胞漿中出現空泡

4、,核染色質濃縮、碎裂成塊彌散在胞漿中,并可見膜結構包裹的凋亡小體。
　　 2 ATRA、As2O3對NB4細胞的增殖抑制作用:統(tǒng)計學分析顯示,ATRA、As2O3及二者聯用對NB4細胞均有增殖抑制作用,隨時間延長,生長抑制率明顯增加,各個時間點間比較,除ATRA組24h與48h之間無統(tǒng)計學差異之外,其他時間點間差異均有統(tǒng)計學意義；同一時間點,各個處理組之間比較,24h各處理組之間無統(tǒng)計學差異,48h與96h各處理組之間均有統(tǒng)計學

5、差異,生長抑制率As2O3+ATRA組大于As2O3組,大于ATRA組；72h As2O3+ATRA大于As2O3組和ATRA組,而As2O3組和ATRA組之間無統(tǒng)計學差異。
　　 3 ATRA、As2O3、ATRA+As2O3對NB4細胞表面CD11b抗原表達的影響:ATRA作用于NB4細胞48h、72h、96h后,CD11b抗原表達分別為(32.47±2.95)％、(84.93±1.45)％、(90.9±0.35)％1 As

6、2O3作用于NB4細胞48h、72h、96h后,CD11b抗原表達分別為(10.97±1.33)％、(15.7±0.87)％、(18.9±0.30)％；ATRA+As2O3作用于NB4細胞48h、72h、96h后,CD11b抗原表達分別為(18.57±0.65)％、(21.17±0.65)％、(26.53±0.83)％。統(tǒng)計學分析顯示:各個處理組隨時間延長,CD11b表達逐漸增多,各個時間點之間有顯著性差異；同一時間點,各處理組間比較,

7、CD11b的表達ATRA組大于ATRA+As2O3組,大于As2O3組,均高于空白對照組,有統(tǒng)計學差異。
　　 4 As2O3、ATRA+As2O3對NB4細胞凋亡的影響:ATRA作用于NB4細胞24h、48h、72h、96h后早期凋亡率分別為(0.57±0.06)％、(0.90±0.20)％、(1.07±0.35)％、(1.20±0.30)％；As2O3作用于NB4細胞24h、48h、72h、96h后早期凋亡率分別為(9.53

8、±0.59)％、(13.77±0.70)％、(18.27±0.35)％、(16.23±1.15)％；ATRA+As2O3作用于NB4細胞24h、48h、72h、96h后早期凋亡率分別為(2.27±0.32)％、(3.93±0.25)％、(7.83±0.40)％、(9.00±0.75)％。經單因素方差分析,在對照組中4個時間點測得的早期、中晚期和總凋亡率無統(tǒng)計學差異,說明自然凋亡對本實驗研究的其他統(tǒng)計結果沒有影響。各個時間點ATRA組與對

9、照組早期凋亡率無統(tǒng)計學差異,24h～72h ATRA組與對照組中晚期凋亡率無統(tǒng)計學差異,96h差異有統(tǒng)計學意義。As2O3作用24h細胞早期凋亡率較高,而在As2O3作用48h以后細胞以中晚期凋亡為主。24h、48h、72h As2O3處理的NB4細胞隨時間延長,早期凋亡率、中晚期凋亡率及總凋亡率均明顯增高,呈時間依賴性,96h較72h早期凋亡率降低,總凋亡率無統(tǒng)計學差異。各個時間點As2O3組凋亡率均高于其他各組,有統(tǒng)計學差異。

10、>　　 5 ATRA、As2O3、ATRA+As2O3對NB4細胞PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10 mRNA表達水平的影響:RQ-PCR檢測結果顯示,以各組各指標空白對照組RQ值為1,ATRA作用于NB4細胞48h、72h、96h后PML/RARα的RQ值分別為:0.4867±0.0040、0.2380±0.0056、0.2137±0.0061；CD44v3的RQ值分別為:0.6437±0.0042、0.6

11、263±0.0047、0.4020±0.0030；CD44v6的RQ值分別為:0.8370±0.0040、0.5417±0.0040、0.4263±0.0051；CD44v10的RQ值分別為:0.4940±0.0026、0.3780±0.0030、0.2643±0.0067；As2O3作用于NB4細胞48h、72h、96h后PML/RARα的RQ值分別為:0.3180±0.0027、0.3030±0.0040、0.2863±0.0047

12、;CD44v3的RQ值分別為:0.6527±0.0045、0.4957±0.0057、0.2223±0.0035；CD44v6的RQ值分別為:0.5817±0.0047、0.5343±0.0042、0.4617±0.00381 CD44v40的RQ值分別為:0.5263±0.0045、0.2490±0.0036、0.3347±0.0040；ATRA+As2O3作用于NB4細胞48h、72h、96h后PML/RARα的RQ值分別為:0.6

13、983±0.0025、0.2717±0.0035、0.1910±0.0036；CD44v3的RQ值分別為:0.45434±0.0047、0.4127±0.0040、0.1980±0.0070；CD44v6的RQ值分別為:0.5027±0.0040、0.3230±0.0020、0.2787±0.0020；CD44v10的RQ值分別為:0.4657±0.0035、0.4260±0.0598、0.1487±0.0035:統(tǒng)計學分析顯示:除AT

14、RA+As2O3組48h與72h之間CD44v10的表達無統(tǒng)計學差異外,各處理組隨時間延長上述各指標的表達均呈遞減趨勢,且各時間點之間有統(tǒng)計學差異。同一時間點,不同處理組之間上述各個指標下降趨勢經統(tǒng)計學分析得出:除72h經ATRA和ATRA+As2O3作用前后CD44v10的變化無統(tǒng)計學差異(P>0.05)外,其他各組均可得出各個時間點的PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v40的mRNA表達經ATRA+As2O3作用

15、后下降最明顯,差異有統(tǒng)計學意義。經繪制散點圖并應用直線相關分析得出:經ATRA、As2O3、ATRA+As2O3作用前后,隨時間延長,PML/RARα與CD44v6的變化趨勢均呈正相關,相關系數分別為r=0.98、r=0.999；As2O3作用前后,隨時間延長,PML/RARα與CD44v3的變化趨勢呈正相關,r=0.965,其他各組之間無直線相關關系。
　　 結論:
　　 1 ATRA、As2O3及二者聯用對NB4細胞

16、具有增殖抑制作用,隨時間延長,生長抑制率明顯增加；同一時間點,各個處理組之間比較,48h、72h和96h As2O3+ATRA組生長抑制率均高于As2O3組和ATRA組。
　　 2 ATRA、As2O3、ATRA+As2O3可誘導NB4細胞表面CD11b的表達增加,且隨作用時間延長表達逐漸增加；同一時間點,各處理組間比較,ATRA組處理的NB4細胞CDl lb的表達明顯高于ATRA+As2O3組和As2O3組。
　　 3

17、 As2O3、ATRA+As2O3可誘導NB4細胞凋亡。隨時間延長,凋亡細胞數增多,呈時間依賴性。As2O3作用24h細胞早期凋亡率較高,48h以后細胞以中晚期凋亡為主。各個時間點不同處理組之間As2O3處理的NB4細胞早期凋亡率、中晚期凋亡率及總凋亡率均明顯高于其他各組。
　　 4 ATRA、As2O3、ATRA+As2O3可使NB4細胞PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10 mRNA的表達下降,呈時間依