缺血預處理抗大鼠腸缺血-再灌注腸粘膜損傷的蛋白質組學研究及醛糖還原酶的作用.pdf

1、腸缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是外科實踐中常見的組織器官損傷之一，在嚴重感染、創(chuàng)傷、休克、心衰以及腸梗阻、小腸移植術等疾病的病理生理演變過程中起重要作用，它不僅引起腸道局部損害，還導致腸外器官的損傷，甚至多器官功能不全。
　　 基于雙向電泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)和質譜分析的蛋白質組學已經有了廣泛的應用。目前，尚無采用蛋白質組學方法探討I

2、PC抗大鼠腸I/R損傷腸黏膜差異表達蛋白的報道。因此，本實驗擬采用阻斷與開放大鼠腸系膜上動脈(superior mesenteric artery,SMA)所致的腸I/R腸黏膜損傷的模型，從以下三部分進行研究：1、復制大鼠腸I/R腸黏膜損傷模型，并確立有效的IPC保護策略，為下一步蛋白組學研究作準備；2、采用2-DE分離腸黏膜差異表達的蛋白，然后采用質譜法鑒定這些蛋白，最后采用逆轉錄聚合酶鏈式反應(Reverse Transcripti

3、on Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)或Western blot技術選擇驗證有意義的差異表達蛋白；3、選擇某一個驗證過的差異表達蛋白，采用其抑制劑來進一步研究它與IPC抗大鼠腸I/R腸黏膜損傷的關系，并探討相關機制。
　　 第一部分缺血預處理對大鼠腸缺血/再灌注腸黏膜損傷的作用
　　 目的：
　　 1.建立大鼠腸I/R腸黏膜損傷的模型。
　　 2.證實有效的抗大鼠腸I/R

4、腸黏膜損傷的IPC策略。
　　 3.為下一步蛋白組學研究作準備。
　　 結論：
　　 1.腸系膜上動脈阻斷60min，開放60min可致大鼠小腸黏膜損傷，提示腸I/R腸黏膜損傷模型能被穩(wěn)定復制。
　　 2.腸系膜上動脈阻斷10min，開放10min，一個循環(huán)的IPC策略對大鼠腸I/R腸黏膜損傷有保護作用，提示本研究中IPC策略是有效的。
　　 第二部分
　　 缺血預處理抗大鼠腸缺血/再灌注

5、腸粘膜損傷的蛋白質組學研究
　　 目的：
　　 1.應用蛋白質組學方法分離、鑒定IPC抗腸I/R腸黏膜損傷的腸黏膜差異表達蛋白。
　　 2.采用RT-PCR或Western blot方法進一步驗證有意義的差異蛋白的表達。
　　 3.初步探討IPC可能的腸保護機制。
　　 方法：
　　 1.動物模型
　　 成年雄性SD大鼠20％烏拉坦0.6ml/100mg腹腔注射后仰臥固定于手術臺，

6、常規(guī)消毒，經腹正中切口，分離SMA，微動脈夾夾閉，縫合切口。60min后經原切口進腹，取出動脈夾，恢復血供，60min后取標本。
　　 2.IPC策略
　　 在長時間阻斷SMA之前，先用動脈夾夾閉SMA10min，再松開10min，一個循環(huán)。
　　 3.實驗分組
　　 24只成年雄性SD大鼠隨機分為3組：
　　 Control組：只分離SMA120min。
　　 Injury組：分離SMA

7、，微動脈夾夾閉，縫合切口。60min后經原切口進腹，取出動脈夾，恢復血供，60min后取標本。
　　 IPC組：在長時間阻斷SMA之前，先用動脈夾夾閉SMA10min，再松開10min，余同Injury組。
　　 4.觀察指標
　　 4.1小腸黏膜組織差異表達蛋白：采用2-DE方法分離腸黏膜組織差異表達的蛋白；采用質譜法鑒定上述差異表達的蛋白。
　　 4.2RT-PCR驗證：分析所有鑒定的差異表達的蛋白，

8、對有意義的(與腸I/R損傷有關)蛋白采用RT-PCR方法驗證，觀察其是否在小腸黏膜組織有表達。
　　 5.統(tǒng)計學分析
　　 所有計量數據以x±s表示，經SPSS13.0統(tǒng)計軟件包處理。多組均數比較使用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。2-DE分析采用ImageMaster2DElite5.0軟件。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.小腸黏膜組織蛋白質組學研究
　　 Co

9、ntrol組、Injury組和IPC組分別有(1287±20)、(1404±20)和(1338±20)個蛋白質點得到分離，Control組和Injury組組間比較有16個差異表達的蛋白，Injury組和IPC組組間比較有14個差異表達的蛋白。經分析文獻后，發(fā)現醛糖還原酶、醛脫氫酶、順烏頭酸酶等蛋白涉及抗氧化、抑制凋亡和改善能量代謝等功能，而這些功能與腸I/R損傷的機制有關。
　　 2.腸I/R和腸IPC對腸I/R后腸黏膜醛糖還原

10、酶mRNA表達的影響
　　 通過文獻復習發(fā)現醛糖還原酶與IPC的心肌保護作用有關，因此推測它也可能與IPC的腸黏膜保護作用有關。故本研究中對其在腸黏膜的表達進行了驗證。Injury組和IPC組的腸黏膜醛糖還原酶mRNA的表達均顯著小于Control組(P＜0.01)，而IPC組顯著高于Injury組(P＜0.05)，與2-DE的結果一致。提示I/R能下調醛糖還原酶的mRNA表達，而IPC可上調其表達。
　　 結論：

11、>　　 1.蛋白質組學研究揭示IPC的腸保護機制可能與其上調醛糖還原酶、醛脫氫酶、順烏頭酸酶等一些具有抗氧化、抑制細胞凋亡及改善能量代謝的蛋白有關。
　　 2.腸I/R下調腸黏膜醛糖還原酶mRNA的表達，IPC能減輕腸I/R導致的腸黏膜醛糖還原酶mRNA表達的下調，提示醛糖還原酶可能介導IPC抗腸I/R腸黏膜損傷。
　　 第三部分醛糖還原酶在缺血預處理抗大鼠腸缺血/再灌注腸粘膜損傷中的作用
　　 目的：

12、　　 1.在第二部分研究基礎上，進一步證實醛糖還原酶在缺血預處理抗大鼠腸缺血/再灌注腸黏膜損傷中的作用。
　　 2.初步探討醛糖還原酶介導缺血預處理抗大鼠腸缺血/再灌注腸黏膜損傷的作用的機制。
　　 結果：
　　 1.小腸組織光學顯微鏡下形態(tài)學及改良的Chiu's評分變化
　　 光鏡下可見Control組腸黏膜完整，Injury組和Epalrestat組損傷嚴重，IPC組和DMSO組損傷輕微。IPC組小

13、腸改良的Chiu's評分和DMSO組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，但均顯著高于Control組(P＜0.01)；Epalrestat組與Injury組均顯著高于IPC組和DMSO組(P＜0.05)，兩組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 2.小腸黏膜組織LD含量的變化
　　 IPC組小腸黏膜LD與DMSO組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，但均顯著高于Control組(P＜0.01)；Epalrestat組與Injury

14、組均顯著高于IPC組和DMSO組(P＜0.05)，兩組問無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 3.小腸黏膜MDA含量的變化
　　 IPC組小腸黏膜MDA含量和DMSO組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，但均顯著高于Control組(P＜0.01)；Epalrestat組與Injury組均顯著高于IPC組和DMSO組(P＜0.05)，兩組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 4.小腸黏膜組織MPO活性的變化
　

15、　 IPC組小腸黏膜MPO活性和DMSO組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，但均顯著高于Control組(P＜0.01)；Epalrestat組與Injury組均顯著高于IPC組和DMSO組(P＜0.05)，兩組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 結論：
　　 1.醛糖還原酶介導缺血預處理抗大鼠腸缺血/再灌注腸黏膜損傷的作用。
　　 2.醛糖還原酶在缺血預處理抗大鼠腸缺血/再灌注腸黏膜損傷中的作用與抑制腸黏膜氧