膽紅素致L-02細胞生長及凋亡影響的研究.pdf

1、目的:探討不同劑量膽紅素致正常人肝細胞 L-02生長及凋亡的變化。
　　方法:將不同濃度的膽紅素(0 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250mg/L、300 mg/L)作用于體外養(yǎng)的正常人肝細胞L-02,用倒置顯微鏡觀察其形態(tài)變化;采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法觀察不同濃度膽紅素作用L-02細胞24h后的相對存活率的影響;不同濃度膽紅素作用24h后,采用DNA瓊脂糖凝膠電泳;不同濃度膽紅素作用12h

2、后流式細胞儀Annexin-V和PI雙標等技術檢測細胞凋亡率;將 L-02接種于6孔板中進行細胞爬片后,用同濃度膽紅素作用24h,多聚賴氨酸處理玻片做免疫組化染色檢測Bcl-2與Bax蛋白的表達。
　　結果:在倒置相差顯微鏡下對正常人肝細胞 L-02進行觀察,對照組細胞24h形態(tài)無明顯變化呈上皮型貼壁生長,細胞呈梭形或多邊形,低濃度(100 mg/L、150 mg/L)膽紅素作用的細胞12h內(nèi)細胞細胞貼壁良好,可見黃染;高濃度(2

3、00 mg/L、250mg/L、300 mg/L)膽紅素作用的細胞2h內(nèi)形態(tài)無明顯改變,4h后可見細胞被黃染,較多細胞突起、變圓,但細胞輪廓清晰,貼壁良好;6h可見細胞輪廓不清,少數(shù)細胞漂浮于培養(yǎng)基中;12h可見較多細胞漂浮,并已開始崩解。MTT法顯示膽紅素作用后L-02細胞的生長受到抑制,各組的OD值分別是0.2251±0.0324、0.2745±0.0466、0.6412±0.0734、0.7295±0.0337、0.7629±0.

4、0327、0.8322±0.0336。各濃度和對照組間、各濃度組見差異具有統(tǒng)計學意義(F=74.4644,p<0.05),除對照組與100mg/L組間比較差異無統(tǒng)計學意義外(q=2.464,p>0.05),其余各時間組間差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。Hoechst33258熒光染色在各實驗組均可見細胞凋亡,其中高濃度(200、250、300 mg/L)膽紅素組更為明顯,大量L-02細胞呈致密濃染,或呈碎塊狀致密濃染。低濃度(100、

5、150 mg/L)膽紅素組和對照組也可見少量細胞凋亡。對照組細胞瓊脂糖凝膠電泳可見,DNA雙鏈完整,相對分子質(zhì)量大,滯留在加樣孔附近,未形成DNA條帶。膽紅素溶液高濃度組(200 mg/L、250mg/L、300 mg/L)出現(xiàn)典型的云梯狀細胞凋亡的DNA ladder,隨濃度增加圖像更清晰、典型。流式細胞儀檢測結果顯示,從0mmol/L劑量組到300mmol/L劑量組,凋亡率從1.24％上升到57.3%,各組之間差異有統(tǒng)計學意義(p<

6、0.05)。Bcl-2在300mg/L組偶見棕黃色顆粒狀,呈散在、弱陽性表達,200mg/L組與300mg/L組相比較陽性細胞數(shù)增多,染色加深,呈黃褐色表達。Bax主要在肝細胞胞漿呈棕黃色顆粒狀;對照組未見陽性表達,200mg/L組可見肝細胞散在、弱陽性表達,較150mg/L組有所增強,陽性細胞數(shù)增多,250mg/L組陽性染色進一步加深,陽性細胞多,300mg/L組肝細胞彌漫陽性染色,染色加深,陽性細胞數(shù)增多。
　　結論:膽紅素可