應用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）法研究瘦素及外力刺激對于軟骨細胞骨架調(diào)控蛋白RhoA的作用.pdf

1、研究背景與目的：骨關節(jié)炎(OA)是骨科的常見疾病之一，是一種退行性關節(jié)疾病，其病因尚不明了。其中，長期超負荷的外力作用是較為公認的OA危險因素之一，因而在體重超重人群中，OA的發(fā)病率顯著增加。瘦素(leptin)是一種白色脂肪組織分泌的小分子量蛋白，在體重超重人群中其血清含量往往升高。2003年Dumond等人發(fā)現(xiàn)OA患者關節(jié)液中瘦素(leptin)含量明顯高于正常人，提示瘦素可能在OA的發(fā)病過程中起到某種作用。RhoA蛋白是調(diào)控細胞骨

2、架的重要分子之一，OA軟骨細胞與正常軟骨細胞的顯著差異之一就是細胞骨架含量的明顯升高。本文擬通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)法，研究活細胞條件下瘦素及外力刺激對于正常軟骨細胞RhoA蛋白的作用，分別探討瘦素、外力對于軟骨細胞細胞骨架的影響，為OA的病因研究提供參考。 研究方法：以編碼YFP-RhoA-PKN-CFP融合蛋白的pRaichu-1237x質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染正常人軟骨細胞。觀察在200ng/ml瘦素刺激下，RhoA蛋白的FRE

3、T信號改變。另外，應用原子力顯微鏡(AFM)作為施力工具，觀察在AFM的輕敲模式與接觸模式作用下，RhoA蛋白的FRET信號改變。 研究結果：在200ng/ml的瘦素作用下，軟骨細胞偽足迅速回縮，F(xiàn)RET信號逐漸減弱消失，直至最終細胞皺縮，形成許多細胞膜周圍的小泡。 軟骨細胞在接受AFM輕敲模式刺激后逐漸出現(xiàn)胞質(zhì)回縮，F(xiàn)RET信號明顯增強，以接觸探針刺激處最為明顯。 軟骨細胞在接受AFM接觸模式刺激后，細胞形態(tài)無

4、明顯改變，F(xiàn)RET信號明顯增強，以接觸探針刺激處最為明顯。 研究結論： (1)以大劑量瘦素(200ng/ml)刺激軟骨細胞，不但不能激活RhoA蛋白，反而會使RhoA蛋白的FRET信號明顯減弱，并導致軟骨細胞逐漸皺縮，最終在細胞膜表面出現(xiàn)類似凋亡小體的小泡，提示大劑量的瘦素可能誘導軟骨細胞的凋亡。 (2)AFM作為施力工具可以直接給予體外培養(yǎng)的軟骨細胞以力學刺激。以AFM的輕敲模式和接觸模式作用于軟骨細胞可以分別