血管平滑肌細胞TLR4的表達意義及siRNA-TLR4對血管平滑肌細胞功能的影響.pdf

1、第一部分：血管平滑肌細胞TLR4的表達 目的：研究血管平滑肌細胞TLR4的表達及在脂多糖(LPS)作用下的表達變化特點。 方法：培養(yǎng)人主動脈平滑肌細胞(HASMCs)，傳到7～9代。不同濃度LPS作用于HASMCs 24小時；10ng/ml LPS作用于HASMCs 0h，2h，4h，6h，12h，24h和48h。應用瓊脂糖電泳鑒定PCR產物；實時熒光定量PCR法對LPS不同作用條件下TLR4 mRNA表達進行定量分析。

2、免疫熒光檢測血管平滑肌細胞TLR4蛋白的位置及分布；Western blot法測定LPS不同作用條件下TLR4蛋白表達量的變化；流式細胞儀進一步檢測LPS不同作用條件下TLR4蛋白表達量的變化。 結果： 1．正常情況下，人主動脈平滑肌細胞表達少量TLR4 mRNA。LPS調節(jié)HASMCs TLR4表達； TLR4 mRNA在LPS作用下發(fā)生時間和劑量依賴性變化。 2．正常情況下，人主動脈平滑肌細胞表達少量TLR4

3、蛋白。LPS調節(jié)HASMCs TLR4表達；受體TLR4蛋白在LPS作用下發(fā)生時間和劑量依賴性變化。 結論：人動脈平滑肌細胞表達TLR4；LPS調節(jié)HASMCs TLR4表達，且在炎性因素作用下，HASMCs TLR4的表達發(fā)生時間和劑量依賴性變化。 第二部分：血管平滑肌細胞TLR4的表達意義 目的：研究血管平滑肌細胞TLR4的表達意義。 方法：培養(yǎng)人主動脈平滑肌細胞(HASMCs)，傳到7～9代。10n

4、g/ml LPS作用于HASMCs 24h。應用瓊脂糖電泳鑒定基質金屬蛋白酶-2，9(MMPs)RT-PCR產物。Western blot法測定10ng/ml LPS作用24小時后，MMP-2，9蛋白表達量的變化。明膠酶譜法測定MMP-2，9活性。EMSA法測定動脈平滑肌細胞核因子-кB(NF-кB)的結合活性。抗受體TLR4抗體抑制LPS激活受體TLR4。吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽抑制NF-кB的結合活性。 結果： 1．L

5、PS通過其受體TLR4調節(jié)MMP-9 mRNA的表達，而對MMP-2 mRNA表達無影響。 2．LPS上調的MMP-9 mRNA能夠翻譯表達更多量的MMP-9蛋白；而對MMP-2蛋白的表達無影響。 3．LPS通過其受體TLR4使血管平滑肌細胞內MMP-9表達增加的同時，使MMP-9酶解活性相應增加；而LPS對MMP-2的酶解活性也沒有產生影響。 4．LPS能夠通過其受體TLR4影響血管平滑肌細胞內NF-кB的結合

6、活性。 5．受體TLR4依賴NF-кB激活途徑調節(jié)MMP-9的表達及活性。 結論：LPS通過TLR4-NF-кB途徑調節(jié)血管平滑肌細胞MMP-9 mRNA和蛋白表達及其活性；而激活受體TLR4對MNIP-2 mRNA和蛋白表達及其活性無影響。 第三部分： siRNA-TLR4對血管平滑肌細胞功能的影響 目的：研究siRNA-TLR4對血管平滑肌細胞功能的影響。 方法：培養(yǎng)人主動脈平滑肌細胞(HAS

7、MCs)，傳到7～9代。應用Lipofectamine<'TM>2000轉染siRNA-TLR4。MTT法測定細胞生存率。實時熒光定量PCR法對轉染siRNA后TLR4 mRNA表達進行定量分析。Western blot法檢測轉染siRNA后TLR4蛋白表達變化。Lipofectamine<'TM>2000轉染TLR4 siRNA-1后，10ng/ml LPS作用于HASMCs 24h，應用瓊脂糖電泳鑒定基質金屬蛋白酶-2，9(MMPs

8、)RT-PCR產物；Western blot法測定10ng/ml LPS作用24小時后，MMP-2，9蛋白表達量的變化；明膠酶譜法測定MMP-2，9活性。 結果： 1．轉染的siRNA序列本身不會對細胞生存率產生影響，同時也說明siRNA序列本身是安全的。 2．3個不同序列siRNA對血管平滑肌細胞TLR4 mRNA表達的抑制效率不同，以TLR4 siRNA-1抑制效率最高。 3．轉染TLR4基因siRN

9、A-1明顯抑制LPS對MMP-9 mRNA表達的上調作用，而對MMP-2的表達無影響。單獨轉染siRNA-1對MMP-2和MMP-9mRNA表達都沒有影響。 4．轉染TLR4基因siRNA-1明顯抑制LPS對MMP-9蛋白表達的上調作用，而對MMP-2的表達無影響。單獨轉染siRNA-1對MMP-2和MMP-9蛋白表達都沒有影響。 5．轉染TLR4基因siRNA-1明顯抑制LPS對MMP-9酶活性的上調作用，而對MMP-