mTOR-STAT3信號通路在IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的成肌細胞增殖、遷移中的作用.pdf

1、目的:增殖和遷移是細胞參與各種細胞反應(yīng)的關(guān)鍵行為，細胞生長因子發(fā)揮其生理功能的主要方式就是通過調(diào)節(jié)效應(yīng)細胞的增殖和遷移。胰島素樣生長因子Ⅰ(insulin-like growth factorⅠ，IGF-Ⅰ)是影響肌肉衛(wèi)星細胞功能狀態(tài)的一個重要細胞因子，因此，對IGF-Ⅰ促進肌肉衛(wèi)星細胞增殖、遷移機制的研究具有現(xiàn)實意義。mTOR/STAT3信號通路是細胞代謝和生長的中央控制器，對細胞的各項生命活動起著重要的調(diào)控作用，而本課題組前期實驗發(fā)

2、現(xiàn)STAT3蛋白在IGF-Ⅰ介導(dǎo)的成肌細胞增殖過程中發(fā)揮著重要作用。基于以上背景本文擬探討mTOR/STAT3信號通路在IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的成肌細胞增殖、遷移中的作用。
　　方法:
　　第一部分:應(yīng)用MTT法檢測10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的IGF-Ⅰ與2％FBS分別作用于L6成肌細胞24h、48h、72h的OD值;根據(jù)MTT結(jié)果選出適宜的IGF-Ⅰ濃度后，實時細胞分析系統(tǒng)(Real Tim

3、e CellAnalyzer，RTCA)連續(xù)監(jiān)測IGF-Ⅰ對L6成肌細胞增殖的影響;用RTCA法檢測以上各組細胞在12h的穿膜細胞數(shù)，從而探討IGF-Ⅰ是否可以促進成肌細胞遷移，并篩選其促進成肌細胞增殖、遷移的最佳濃度。
　　第二部分:根據(jù)第一部分實驗結(jié)果，選取100ng/ml IGF-Ⅰ作用于L6成肌細胞，以2％FBS作對照，在0min，20min，30min，1h，2h，4h，12h，24h，48h后提取細胞總蛋白，利用免疫印

4、跡技術(shù)(Western Blot)檢測IGF-Ⅰ刺激成肌細胞后mTOR/STAT3信號通路活化水平，從而探討mTOR/STAT3信號通路是否被激活。
　　第三部分:將細胞分為2％FBS對照組、50μmol/L雷帕霉素(rapamycin，RAPA)+100ng/mlIGF-Ⅰ處理組、100ng/mlIGF-Ⅰ處理組三組，用Western Blot觀察各組目的蛋白磷酸化水平的變化，應(yīng)用MTT法檢測24h、48h、72h成肌細胞增殖的

5、變化;用RTCA法檢測12h成肌細胞遷移能力的變化，驗證IGF-1促進成肌細胞增殖、遷移過程中mTOR/STAT3信號通路的作用。
　　結(jié)果:
　　第一部分:在同一時間，高濃度(50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml)的IGF-Ⅰ具有促進L6成肌細胞增殖的作用(p＜0.05)，以100ng/ml，200ng/ml的IGF-Ⅰ促進作用更為顯著(p＜0.01);10ng/ml則無明顯促進作用(p＞0.05)。100n

6、g/ml，200ng/ml的IGF-Ⅰ能有效促進L6成肌細胞遷移(p＜0.01)，而較低濃度(0ng/ml，10ng/ml，50ng/ml)的IGF-Ⅰ則無明顯促遷移作用(p＞0.05)。
　　第二部分:實驗組細胞各時間點之間哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(themammalian target of rapamycin，mTOR)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signaltransducers and activators of tran

7、scription3，STAT3)總蛋白表達量無明顯差異，然而mTOR及STAT3蛋白活化水平(p-mTOR、p-STAT3)均隨IGF-Ⅰ作用時間延長而升高，在4h達到峰值，隨后降低，然而在48h其蛋白磷酸化水平仍顯著高于IGF-Ⅰ作用起始，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，即IGF-Ⅰ作用下，mTOR/STAT3信號通路被激活。
　　第三部分:RAPA顯著抑制了IGF-Ⅰ激活的目的蛋白磷酸化水平，且該通路抑制劑RAPA的加入顯