抗Fas錘頭狀核酶增強小鼠T細胞殺傷粒-單核白血病細胞作用的研究.pdf

1、移植后復發(fā)仍是對許多血液病人施行異基因骨髓移植的主要障礙之一。近年來的臨床移植實踐證實供者淋巴細胞輸注(DLI)進行過繼性免疫治療在誘導GVL作用，鞏固供者型嵌合體，治療異體造血干細胞移植(Allo-HSCT)后復發(fā)，以及移植后病毒感染等方面取得了可喜效果。更有研究表明，Allo-HSCT根治白血病不僅是移植前預處理的結果，移植后供者淋巴細胞的GVL起著根本性功效。體內(nèi)外實驗證實供者T淋巴細胞(包括CD4+和CD8+細胞)在DLI后誘導

2、的GVL效用中起重要作用，CD4+T細胞在抗原提呈細胞(APC)的參與下，識別白血病細胞編碼的抗原而被活化，進而激活CD8+T細胞使之成為效應性CTL，CTL可識別白血病細胞表面的MHC-Ⅰ類分子-白血病抗原肽復合物，被激活而發(fā)揮GVL作用?；罨腡細胞表面Fas及FasL表達均增高，而大量研究表明在體內(nèi)異常微環(huán)境及一系列細胞因子的作用下，白血病細胞表面可高表達FasL，并可通過Fas-FasL途徑誘導Fas+的T細胞凋亡，降低其GVL

3、效應，從而逃逸免疫應答，即所謂白血病細胞的“Fas反擊”作用。從提高DLI誘導的GVL效應的角度出發(fā)，本課題構建了針對小鼠Fas的錘頭狀核酶，將其導入小鼠T細胞，觀察該核酶對T細胞凋亡、增殖以及T細胞對粒單核白血病細胞株(WEHI-3)殺傷作用的影響，探索供者淋巴細胞輸注時提高GVL作用的新途徑。 第一部分切割小鼠FASmRNA錘頭狀核酶的構建及其體內(nèi)外切割活性的鑒定 [目的]設計合成了針對小鼠FASmRNA的錘頭狀核酶

4、基因，構建其細胞外轉錄載體和真核表達載體，使其在U6RNA聚合酶Ⅲ的作用下于細胞內(nèi)高效轉錄。并篩選出細胞外切割活性最佳的核酶，以高表達FAS的小鼠淋巴瘤細胞株Yac-1作為模型，研究核酶修飾的FAS基因對該細胞Fas表達及增殖的影響，探索更為有效的抗凋亡的新途徑，并為后續(xù)的研究奠定基礎。 [方法]設計并合成針對小鼠FASmRNA93，140和596位點的錘頭狀核酶，同時合成針對596位點的突變型核酶(G3→A3)作為對照，以排除

5、反義序列互補作用。應用分子克隆技術構建核酶的細胞外轉錄和真核表達載體，使核酶在U6RNA聚合酶Ⅲ啟動子作用下高效轉錄。胞外轉錄出核酶和靶基因，進行細胞外切割反應檢測四種核酶對FAS的切割作用，篩選出切割效率最佳的核酶。通過電穿孔轉染法將篩選出的核酶穩(wěn)定導入Yac-1細胞，RT-PCR測細胞內(nèi)核酶的表達，通過RT-PCR、免疫組化檢測細胞上FAS的表達，細胞經(jīng)抗小鼠FAS的抗體(JO2)作用后，通過MTT法觀察細胞的增殖情況。 [

6、結果]測序證實核酶基因被正確克隆入細胞外轉錄載體pBSKU6和真核載體pEGFPPC1中。僅RZ596在細胞外具有切割靶基因的活性，切割效率達60％，RZ93、RZ140與突變型核酶無明顯切割作用。通過電穿孔轉染法將RZ596成功導入高表達FAS的Yac-1細胞，RT-PCR證實嵌于U6啟動子中的核酶在細胞內(nèi)高效表達。RT-PCR和免疫組化結果提示FAS在mRNA和蛋白水平的表達明顯下降，細胞經(jīng)抗小鼠的JO2抗體作用后，轉染核酶的細胞增

7、殖活性較對照組明顯增高，與之相反，轉染突變型核酶dRZ596的細胞無此結果。 [結論]本課題構建的U6嵌合型錘頭狀核酶RZ596在細胞內(nèi)和細胞外均具能有效切割FAS，且轉染至細胞后能高效表達，抑制細胞內(nèi)Fas基因和蛋白的表達，增強了細胞的增殖活性，為研究抑制T細胞的凋亡從而增強其對WEHI-3的殺傷提供實驗基礎。 第二部分錘頭狀核酶增強小鼠T細胞殺傷粒-單核白血病細胞作用的研究 [目的]研究針對FASmRNA59

8、6位點的錘頭狀核酶對原代培養(yǎng)的小鼠脾臟T細胞和CTL細胞系CTLL-2上FAS表達及其介導的凋亡的抑制作用，探索增強T細胞對粒單核白血病細胞株(WEHI-3)殺傷作用，提高供者淋巴輸注(DLI)時T細胞GVL效應的新途徑。 [方法]通過尼龍棉柱法分離小鼠脾臟T細胞，與CTLL-2在IL-2條件下常規(guī)培養(yǎng)，經(jīng)流式細胞儀測得其CD3和FAS的表達。通過電穿孔轉染法將pEGFP-RZ596與pEGFPC1導入T細胞，通過RT-PCR和

9、Westernblot分別檢測T細胞上FasmRNA和蛋白水平的表達；細胞與高表達FasL的小鼠急性粒-單核細胞白血病細胞株(WEHI-3)混合培養(yǎng)后，通過caspase-3活性檢測試劑盒測各組細胞caspase-3活性的變化，MTT法測各組細胞的增殖情況，Annexin-V凋亡檢測試劑盒測細胞凋亡，以乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗檢測CTL的體外殺傷活性。 [結果]尼龍棉柱法成功分離了小鼠脾臟T細胞(CD3陽性率大于90％)，經(jīng)

10、IL-2活化后高表達Fas。電穿孔轉染法能將核酶成功地導入小鼠T細胞，與對照組、空載體轉染組相比，細胞表面的Fas表達明顯降低；與WEHI-3孵育后，與空白對照、轉染空載體的細胞相比，轉染核酶的細胞增殖活性明顯增加，而細胞的caspase-3活性降低，且細胞的凋亡率顯著降低，且T細胞的體外殺傷活性亦顯著增強。 [結論]小鼠活化T細胞和細胞因子處理的CTLL-2上表達Fas，抗Fas核酶能顯著降低其Fas水平，使細胞免于Fas途徑