腦血管痙攣中縫隙連接蛋白Cx43、Cx40磷酸化水平及其磷酸化位點(diǎn)分析.pdf

1、目的：
　　 心腦血管系統(tǒng)中主要表達(dá)和起作用的縫隙連接蛋白為Cx43和Cx40，其磷酸化在許多心腦血管疾病中扮演著重要角色。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，分析腦血管痙攣中縫隙連接蛋白Cx43、Cx40的磷酸化水平并利用質(zhì)譜技術(shù)篩選出其磷酸化位點(diǎn)。為更深入研究縫隙連接蛋白Cx43、Cx40磷酸化參與蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后腦血管痙攣(CVS)的機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，并為下一步篩選出對(duì)CVS有效藥物提供靶點(diǎn)。
　　 方法：

2、>　　 1、ET-1誘導(dǎo)的SD大鼠腦基底動(dòng)脈血管條CVS模型的建立：采用同種系SD大鼠，麻醉后斷頭取腦，顯微鏡下分離腦基底動(dòng)脈，將其剪成完整的動(dòng)脈條，400pmolET-1孵育動(dòng)脈條，建成ET-1誘導(dǎo)的SD大鼠腦基底動(dòng)脈血管條CVS模型。
　　 2、CVS模型的檢測(cè)：分為ET-1刺激組和正常組，比對(duì)ET-1刺激后血管條發(fā)生的張力變化。
　　 3、CVS組和正常組中Cx43、Cx40磷酸化水平的分析：利用磷酸化蛋白富集試

3、劑盒富集CVS組和正常組中的磷酸化總蛋白，再利用Western Blotting技術(shù)分析CVS組和正常組中Cx43、Cx40磷酸化水平的改變。
　　 4、CVS中Cx43、Cx40磷酸化位點(diǎn)的檢測(cè)：利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)CVS中Cx43、Cx40磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析，篩選出CVS中Cx43、Cx40發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功建立ET-1誘導(dǎo)的SD大鼠腦基底動(dòng)脈血管條CVS模型，血管條張力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，

4、ET-1刺激后血管條張力發(fā)生明顯的改變。
　　 2、正常腦基底動(dòng)脈中Cx43、Cx40都處于相對(duì)較低的磷酸化水平，但與Cx43相比，Cx40處于相對(duì)較高的的磷酸化水平。
　　 3、CVS后Cx43、Cx40磷酸化水平明顯升高，然而比較Cx43、Cx40磷酸化蛋白表達(dá)量發(fā)現(xiàn)CVS中磷酸化GJ蛋白的表達(dá)主要以Cx40為主。
　　 4、前期我們研究表明正常腦基底動(dòng)脈平滑肌層的GJ蛋白主要為Cx40，CVS后則以Cx43

5、的表達(dá)為主，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)：CVS后腦基底動(dòng)脈平滑肌中總蛋白的表達(dá)主要為Cx43，而磷酸化蛋白的表達(dá)則以Cx40為主。
　　 5、對(duì)CVS中Cx43與Cx40進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)檢測(cè)，分別篩選出Cx40的9個(gè)磷酸化位點(diǎn)和Cx43的4個(gè)磷酸化位點(diǎn)。
　　 結(jié)論：
　　 CVS后這種總蛋白與磷酸化蛋白表達(dá)的不一致可能在CVS的病理過程中起到重要作用。并且篩選出來的Cx40的9個(gè)磷酸化位點(diǎn)和Cx43的4個(gè)磷酸化位點(diǎn)可