雌激素和選擇性雌激素受體調節(jié)劑抑制前列腺癌細胞系PC3生長的實驗研究.pdf

1、本研究分別探討了17 β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬通過ER激活MAPK通路對前列腺癌細胞PC3生長的影響。 研究材料與方法： 1、17β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬對PC3細胞生長的抑制作用不同濃度17β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬作用PC3細胞48、72、96、120h后，應用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢細胞生長抑制率。細胞生長抑制率(％)=(1一試驗組光A<,490>/對照組光An90)×100％。實驗重復3次。

2、 2、細胞凋亡形態(tài)學檢測17 β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬作用PC3細胞48 h后，按照試劑盒說明應用Hoechst染色檢測細胞凋亡形態(tài)學變化，熒光顯微鏡下觀察。 3、免疫組織化學方法檢測Bcl-2和caspase-3表達17β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬作用PC3細胞48 h后，按照博士德免疫組織化學試劑盒說明染色，顯微鏡下觀察Bcl-2和caspase-3的表達強度。 4、ERK1/2、JNK和p38活性的測定17β雌

3、二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬作用PC3細胞不同時間后，提取蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，應用western blot檢測PC3細胞中磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)、磷酸化的JNK(p-JNK)和磷酸化的p38(p-p38)的表達，以及ERK1/2，JNK和p38的表達，以p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK和p-p38/p38代表MAPK的激活量。分別應用10μmol/l MEK1/2抑制劑PD98059、J

4、NK抑制劑SP600125和p38抑制劑SB203580預先和細胞孵育1h后應用17 β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬作用30min，應用western blot檢測ERK1/2、JNK和p38的活性，明確上述抑制劑抑制藥物對MAPK的激活作用。 5、細胞周期分布檢測收集經不同藥物處理48h后的細胞，PI染色法用流式細胞儀檢測細胞亞二倍體峰和細胞周期分布，應用CellQuest 3.0軟件采集數據，應用ModFit軟件分析，結果用百

5、分率表示。 6、ERα、ER β、細胞周期蛋白依賴激酶抑制蛋白(P21<'WAF1>)、細胞周期蛋白D1(cyclinDl)基因表達的檢測收集經不同藥物處理或未處理18h后的細胞，Trizol提取總RNA，應用TaKaRa公司的RT-PCR試劑盒擴增上述基因，PCR產物1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，生物圖象分析儀檢測吸收光度值進行半定量分析。 7、TLINEL染色檢測細胞凋亡率不同藥物作用PC3細胞48h后，按照博士德TUN

6、EL試劑盒說明染色，顯微鏡下觀察，凋亡細胞核呈棕黃色，每張切片隨機選取10個高倍視野，計數100個細胞，以其中凋亡細胞占的百分比作為細胞凋亡率。 8、Bcl-2、caspase-3、Bax、p-Bcl-2的表達不同藥物作用PC3細胞特定時間后，提取蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，應用western blot檢測PC3細胞中上述蛋白表達的變化。 9、統(tǒng)計學分析各組間比較采用單因素方差分析。 研究結果：

7、 RT-PCR在PC3細胞中檢測到ERα和ERβ表達，并且發(fā)現其表達ERα異構體。MTT檢測發(fā)現17β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬呈濃度依賴性抑制PC3細胞增殖。17β雌二醇、他莫昔芬和雷洛昔芬抑制PC3生長的最小濃度分別為10<'-5>mol/l、 10<'-6>mol/l和10<'-7>mol/l。10<'4> mol/1 17β雌二醇、10<'5>mol/l他莫昔芬和10<'-6>mol/l雷洛昔芬分別作用48h后，Hoechst染

8、色在處理組發(fā)現典型凋亡改變，正常細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈致密濃染和呈碎塊狀致密濃染的典型凋亡表現。免疫組織化學發(fā)現10<'-4>mol/17β雌二醇、10<'-5>mol/l他莫昔芬和10<'-6>mol/l雷洛昔芬分別作用48h后，PC3細胞中Bcl-2的表達比對照組表達減少，caspase-3的表達則比對照組表達增加。 Western blot檢測表明在10<'-4> mol/l 17β雌二醇和10<'-5>mol/l他莫

9、昔芬在PC3細胞中以時間依賴的方式瞬間激活ERK1/2、JNK和p38信號通路。而10<'-5>mol/l雷洛昔芬僅激活ERK1/2和p38信號通路，但不激活JNK通路。10μmol/l PD98059、SP600125和SB203580分別預先和細胞孵育1h則可以完全抑制上述藥物對MAPK信號通路的激活。 流式細胞檢測發(fā)現10<'-4>mol/l 17 β雌二醇作用48h后PC3細胞周期阻滯于G<,1>期，10μmol/l P

10、D98059預處理1h后使10<'-4>mol/l 17β雌二醇作用48h的細胞進一步阻滯在G<,1>期，10μmol/l SP600125預孵育1h后減輕10<'-4>mol/l 17β雌二醇作用48h引起的細胞周期阻滯，10gmol/l SB203580預孵育1h后則使10<'-4>mol/l 17β雌二醇作用48h的細胞進入S期。10<'-5>mol/l他莫昔芬作用48h后PC3細胞周期阻滯于G<,1>期，10μmol/l PD9

11、8059預處理1h后使10<'-5>mol/l他莫昔芬作用48h的細胞輕度阻滯在G<,1>期，10μmaol/l SP600125預孵育1h后10<'-5>mol/l他莫昔芬作用48h細胞依然阻滯在G<,1>期，10μmol/l SB203580預孵育1h后則使10<'-5>mol/l他莫昔芬作用48h的細胞進入S期。10<'-6>mol/l雷洛昔芬作用48h后PC3細胞周期阻滯于G<,1>期，10μmol/l PD98059預處理1h

12、后使10<'-6>mol/l雷洛昔芬作用48h的細胞輕度阻滯在G<,1>期，10μmol/l SB203580預孵育1h后則使10<'-6>mol/l雷洛昔芬作用48h的細胞周期輕度阻滯在G<,1>期。 研究結論： 17 β雌二醇通過持續(xù)激活JNK增加P21<'WAF1>基因表達，同時激活p38減少cyclinDl表達，使細胞阻滯在G<,1>期。其還通過持續(xù)激活JNK和p38通路引起PC3細胞凋亡。但17 β雌二醇同時通

13、過激活ERK1/2通路又可以輕微拮抗上述作用。他莫昔芬通過持續(xù)激活ERK1/2增加P21<'WAF1>基因表達，同時激活p38減少cyclinD1表達，進而使細胞阻滯在G<,1>期。其還通過持續(xù)激活JNK和p38引起B(yǎng)cl-2磷酸化使Bcl-2失效降解，促進PC3細胞凋亡。 雷洛昔芬通過持續(xù)激活ERK1/2增加P21<'WAFI>基因表達，同時激活p38減少cyclinD1表達，進而使細胞阻滯在G<,1>期。雷洛昔芬通過激活p3