人肝細胞生長因子基因促進大鼠缺血后肢血管新生的實驗研究.pdf

1、多階段、多平面——難治性下肢動脈硬化閉塞癥是血管外科治療的難點。由于缺乏理想的遠端流出道，使血管搭橋、腔內血管成形等常規(guī)血管外科技術難以有效實施；藥物治療也未取得突破性進展。最終相當一批患者由于嚴重缺血導致的靜息痛、難以愈合的潰瘍感染和壞疽，不得不選擇截肢，甚至約10％的截肢患者一段時間后還得考慮二次高位截肢。積極尋求治療難治性動脈硬化閉塞癥的新策略是當前迫切需要解決的重大的現(xiàn)實問題。 目前認為下肢動脈缺血的病理學原因是缺血肢體

2、的主要動脈閉塞，遠端肢體的血供基本依靠側支循環(huán)，當自發(fā)性的側支循環(huán)血供不能滿足組織灌注時，缺血隨即發(fā)生。分子生物學和分子病理學的發(fā)展使血管發(fā)生的分子機制部分被闡明，細胞因子被認為起著重要的始動和維持作用?！爸委熜匝苄律钡睦砟钜矐\而生，既向阻塞動脈近段轉染具有血管再生作用的生長因子或相應基因，促使血管內皮細胞增殖，形成大量新生血管，跨越阻塞動脈段，建立豐富側支循環(huán)，以改善缺血組織的血供。第一個用于促血管新生的因子是VEGF家族成員和

3、FGF家族成員，已知腺病毒介導VEGF165，VEGF121和FGF4基因轉染治療缺血性心血管疾病已進入臨床實驗階段，具有較高的臨床應用價值。 肝細胞生長因子(HGF)是一種間質來源的多效性因子，在血管內皮細胞和血管平滑肌細胞均有表達，從而HGF在這些組織中以旁分泌形式顯示增殖、遷移、形態(tài)形成、再生以及凋亡抑制等多種多樣的生物活性作用。近年來發(fā)現(xiàn)HGF同樣具有強烈的促血管生成作用，與VEGF相比其特點表現(xiàn)為：1.在血管組織中對內

4、皮細胞有相對特異性，促進其增殖、遷移，但對血管平滑肌細胞僅促進遷移而不引起增殖；2.促內皮細胞分裂活性在體內、外均較VEGF強；3.HGF在缺血組織中表達明顯減少而其特異性受體C-met則被上調；4.對內皮細胞有抗凋亡活性；5.HGF可升高基質金屬蛋白酶(MMP-1)水平和uPA活性；6.其直接促內皮細胞生長和間接的刺激血管平滑肌細胞生成VEGF的雙重促血管生成機制似乎比VEGF有更明顯的療效；7.并且HGF沒有血管通透性這一副作用等這

5、些性質使其臨床應用前景更加廣闊。 近來日本學者通過將裸HGF質粒直接注射到動脈缺血肢體骨骼肌中的方法，成功完成了HGF基因治療動脈缺血肢體的動物實驗，效果喜人。國內已見少量報道，但不完善。本研究構建了真核細胞表達質粒pEGFP-HGF-C1，通過基因轉染從體外、體內實驗觀察了對大鼠血管內皮細胞增殖和血管新生的作用。本研究分三個部分，分述如下： 第一部分pEGFP-HGF-C1真核表達質粒的構建目的：獲取人HGFcDNA，

6、構建真核細胞表達質粒。 方法：酶切pCMV-HGF，獲得人HGFcDNA全長并鑒定；將其插入以CMV為啟動子、GFP為報告基因的真核表達載體pEGFP-C1中，擴增后挑取插入方向正確的克隆，最后測序鑒定。 結果：酶切所得HGFcDNA經(jīng)測序鑒定為人胎盤HGFcDNA全長序列的-27～2246處堿基；插入載體pEGFP-C1中，擴增后挑取陽性菌落；PCR法鑒定獲得正向表達HGF的真核細胞表達質粒pEGFP-HGF-C1，測

7、序無誤，構建成功。 第二部分HGF基因促進大鼠血管內皮細胞增殖的體外研究目的：觀察質粒pEGFP-HGF-C1轉染大鼠骨骼肌細胞后，上清液中表達的HGF對ECs的作用。 方法：胰酶消化法建立大鼠原代骨骼肌細胞，差速貼壁法純化，經(jīng)Desmin免疫細胞化學法和電鏡法鑒定；貼塊法建立大鼠原代血管內皮細胞，八因子相關抗原免疫熒光鑒定；使用脂質體向骨骼肌細胞轉染質粒pEGFP-HGF-C1，測定轉染效率；ELISA法測定細胞上清液

8、中HGF表達濃度；MTT比色法測定HGF對ECs促增殖作用。 結果：通過胰酶消化法建立了大鼠原代骨骼肌細胞，傳代時以差速貼壁法純化，使骨骼肌細胞純度達到80％，細胞融合分化后可見肌管形成，經(jīng)骨骼肌細胞特異性標志物Desmin免疫細胞化學法和電鏡法鑒定，證明培養(yǎng)的細胞是骨骼肌細胞，取2-4代做實驗用；通過貼塊法建立了大鼠原代血管內皮細胞，細胞融合可見典型的“鋪路石”樣表現(xiàn)，經(jīng)八因子相關抗原免疫熒光鑒定，證明培養(yǎng)的細胞是血管內皮細胞

9、，并取2-4代做實驗用；優(yōu)化條件后，使用陽離子脂質體LipofectamineTM2000以質粒：脂質體為1μg：1.5μl向骨骼肌細胞轉染質粒pEGFP-HGF-C1，以GFP熒光表達間接代表HGF表達，測定轉染效率為0.8％；ELISA法測定細胞上清液中HGF濃度，第1天HGF表達656.3±170.5pg/ml，第4天達到高峰為5402.0±227.9pg/ml，并至少持續(xù)到轉染后的第9天575.1±146.3pg/ml，空載和空

10、白對照組沒有測出；用0.25ng/ml、0.50ng/ml、1.00ng/ml、2.00ng/ml四種不同濃度的HGF及空載和空白對照組細胞上清液處理血管內皮細胞后，使用MTT比色法測定細胞存活率，結果表明HGF對大鼠血管內皮細胞具有促增殖作用，同對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)，這種促增殖作用具有量效和時效關系，濃度應在1.00ng/ml以上，作用時間為3天。 第三部分HGF基因治療促進大鼠缺血后肢血管新生的體內實驗目的

11、：觀察質粒pEGFP-HGF-C1對大鼠急性缺血肢體血管新生的作用 方法：建立大鼠急性缺血肢體模型；裸質粒pEGFP-HGF-C1200μg/500μ1直接注射缺血肢體肌肉，術后3、6、9天取標本行HGF免疫組織化學和蛋白印跡檢測；術后24天取標本行血管內皮細胞標記物CD31免疫組化檢測，估算毛細血管密度，以評價血管新生情況。 結果：蛋白印跡HGF表達灰度比結果顯示治療組于3、6、9天分別是5.52±0.70、2.37±

12、0.36、3.53±0.43，同空載和空白對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)；免疫組化HGF表達面密度結果顯示治療組于3、6、9天分別是0.386±0.037、0.318±0.043、0.286±0.044，同空載和空白對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)；術后24天治療組、空載組、空白組毛細血管密度(個/200倍視野)分別為10.81±2.35、6.11±0.90、5.45±0.90，治療組明顯增高，差異有顯著性(P＜0.01)

13、。 總之，通過以上三部分實驗得出以下結論：1.作為本實驗的基因治療載體工具，pEGFP-HGF-C1在真核細胞中表達HGF-GFP融合蛋白，在熒光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，可作為目的基因表達的間接證據(jù)。 2.質粒pEGFP-HGF-C1通過陽離子脂質體體外轉染大鼠骨骼肌細胞，轉染效率可達0.8％，表達HGF可持續(xù)9天以上，1.5×105細胞最高峰(第4天)可產生2.7ng的HGF。 3.基因轉染后骨骼肌細胞分泌的HGF

14、對大鼠血管內皮細胞有促增殖作用，說明HGF-GFP融合蛋白有功能，且具有量效關系和時效關系，作用濃度應在1.00ng/ml以上，作用時間為3天。 4.裸質粒pEGFP-HGF-C1直接注射到大鼠急性缺血肢體肌肉中，可被缺血骨骼肌細胞攝取且目的基因HGF得到表達，并可持續(xù)9天以上，但隨時間的推移有下降的趨勢。 5.在術后24天的缺血肌肉組織中，治療組的毛細血管密度明顯高于對照組，說明了質粒pEGFP-HGF-C1轉染缺血肌