eNOS-NO上調PGC-1α發(fā)揮內皮細胞保護作用的機制研究及丁基苯酞在其中的作用.pdf

1、目的：以大鼠主動脈內皮細胞(SVAREC)作為研究對象，進一步探討NBP發(fā)揮保護作用的關鍵靶點。觀察糖氧剝奪/復氧(OGD/R)條件下，作為獨立于缺氧誘導因子HIF外的另一種促進血管增生的因子PGC-1α及其下游VEGF表達水平的變化，探討其可能的調控機制。并且進一步觀察NBP作用前后，內皮細胞活性變化、抗氧化損傷能力的改變、核損傷情況、以及細胞內PGC-1α、VEGF表達水平的變化等。擬初步探討NBP在OGD/R條件下發(fā)揮細胞保護作用

2、的具體機制，是否與保護eNOS、上調PGC-1α有關。以尋找NBP血管保護作用的具體靶點，更好地為缺血性腦血管病的治療提供理論依據。 方法：⑴首先進行預實驗，采用免疫熒光和Western—Blot的方法，觀察NBP是否能增加OGD/R條件下內皮細胞中VEGF的表達；從而在細胞模型上驗證其在大體模型上已經觀察到的促血管增生現(xiàn)象。⑵機制探討：實驗中采用特異性的eNOS激動劑CaI和抑制劑L—NIO，分別促進和降低eNOS活性；用免疫

3、熒光和Western—Blot的方法檢測正常和OGD/R條件下內皮細胞中PGC-1α、VEGF表達水平的變化；從而證明eNOS—NO是否參與內皮細胞PGC-1α上游的表達調控。⑶采用特異性的eNOS激動劑CaI和抑制劑L—NIO，分別促進和降低OGD/R條件下 eNOS活性，采用Western—Blot的方法，觀察NBP是否通過eNOS—NO對OGD/R條件下PGC-1α、VEGF的表達產生影響。⑷用MTT的方法檢測細胞活性、測定OGD

4、/R后細胞SOD酶活性的變化、以及核染色的方法驗證NBP是否通過eNOS對OGD/R條件下內皮細胞產生保護作用。 結果：①免疫熒光及WB的結果均表明，NBP1.0μM能明顯增加正常及OGD6h/R12h后內皮細胞內VEGF的表達。運用IPP圖像處理軟件，并進行統(tǒng)計學分析可以得出這種增高具有統(tǒng)計學意義。②從熒光圖片上可以看到，PGC-1α這種轉錄激活因子主要在胞核內表達。外源性的NO donor SNAP并未使PGC-1α表達增高

5、；而特異性eNOS抑制劑卻能減低正常細胞中PGC-1α的表達。差異具有統(tǒng)計學意義。WB分析蛋白水平我們也得到類似的結果；說明eNOS—NO對正常內皮細胞中PGC-1α的表達至關重要。WB還發(fā)現(xiàn)PGC-1α下游的VEGF也存在著類似的變化趨勢；即eNOS—NO對正常內皮細胞中VEGF的表達亦至關重要。③WB的結果表明，OGD6h/R12h后PGC-1α表達增高，使用了eNOS激動劑之后這種增高更加明顯；而使用eNOS抑制劑之后，PGC-1

6、α水平降至正常以下。其下游的VEGF也存在著同樣的變化趨勢。說明eNOS—NO能上調OGD/R條件下內皮細胞中PGC-1α、VEGF的表達。④WB的方法我們發(fā)現(xiàn)，NBP能使OGD/R條件下增高的PGC-1α表達進一步增多；具有統(tǒng)計學意義。而這種促進作用在用了eNOS抑制劑之后有所減低?？梢钥闯鯪BP正是通過eNOS而起到上調PGC-1α的作用的。其下游的VEGF亦存在著類似的變化趨勢。⑤OGD6h/R12h后內皮細胞SOD酶活性明顯降低

7、(約56％)；而用了NBP之后能很好的保護酶活性(上升約44.2％)；但這種保護作用在用了eNOS抑制劑之后消失。說明NBP抗氧化損傷的能力部分與eNOS相關。⑥OGD/R之后內皮細胞活性(MTT值)明顯下降(約55％)；而NBP能使細胞活性上升約26％；同樣的這種保護作用在運用了eNOS抑制劑之后減低(約23％)。⑦核染色的熒光圖片上可以看到：正常細胞核圓形或類圓形、邊界整齊、染色均勻。而OGD/R之后，胞核皺縮、核邊界不整、核碎裂增

8、多、染色濃染或聚集。加入了NBP之后能明顯減輕這種核損傷改變。eNOS抑制劑則使NBP的保護作用消失。這種變化趨勢具有統(tǒng)計學意義。 結論：⑾在體外內皮細胞模型上證明了NBP能上調OGD/R條件下血管內皮生長因子(VEGF)的表達，促進血管增生。⑵內源性eNOS—NO對正常內皮細胞PGC-1α、VEGF的表達至關重要；并在OGD/R條件下能上調兩者的表達。⑶NBP通過保護eNOS，上調OGD/R條件下PGC-1α、VEGF的表達，