Barrett食管分化機(jī)制研究.pdf

1、Barrett食管多由嚴(yán)重而長(zhǎng)期的胃和十二指腸內(nèi)容物反流刺激食管下段所致，正常的復(fù)層鱗狀上皮被單層柱狀上皮所取代的一種病理現(xiàn)象。隨著認(rèn)知和現(xiàn)代化的發(fā)展，我國(guó)胃食管反流病的發(fā)生愈來愈多，BE的發(fā)病率也逐年增加。BE被認(rèn)為是一種癌前病變，與食管腺癌密切相關(guān)，其癌變的危險(xiǎn)性較一般人群高出30～125倍。諸多研究已證實(shí)腸化生型BE上皮易于向食管腺癌演變，腸化生型BE是研究的熱點(diǎn)，近年也逐漸引起國(guó)內(nèi)學(xué)者的重視，但遺憾的是研究多著眼于BE的臨床分析

2、和BE演變?yōu)槭彻芟侔┑臋C(jī)制，而極少涉及BE形成的機(jī)制研究。從早期的研究發(fā)現(xiàn)BE腸化生細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)與正常小腸上皮類似，到近年利用小腸標(biāo)志物來監(jiān)測(cè)食管腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的研究，都提示腸化型BE與正常小腸上皮存在共性。
　　 Wnt-β-catenin/Tcf4及Notch-Delta-Hes1-Math1信號(hào)途徑在維持正常狀態(tài)下小腸上皮的增殖和分化中作用重要。
　　 Wnt-β-catenin/Tcf4信號(hào)途徑維持正常狀態(tài)下小腸

3、上皮的增殖，Wnt途徑被激活后，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞漿內(nèi)聚集并與 DNA結(jié)合蛋白 Tcf/LEF家族成員相互結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞增殖。Tcf-4基因敲除小鼠的模型，表現(xiàn)為小腸隱窩干細(xì)胞數(shù)目減少，失去功能，最終導(dǎo)致小鼠死亡。
　　 正常狀態(tài)下，Notch-Delta-Hes1-Math1信號(hào)途徑通過Hes1對(duì)Math1的負(fù)調(diào)控作用，來決定小腸早期祖細(xì)胞的分化方向，從而形成不同種類的小腸細(xì)胞。
　　 本研究檢測(cè)了BE

4、活檢組織中Wnt及Notch信號(hào)途徑中的關(guān)鍵分子的表達(dá)，并將人正常食管鱗狀上皮細(xì)胞經(jīng)酸、膽汁酸及兩者的混合物處理。觀察其形態(tài)變化，檢測(cè)Wnt及Notch信號(hào)途徑中的關(guān)鍵分子的表達(dá)，試圖探討B(tài)E發(fā)生的可能機(jī)制。
　　 第一部分：Barrett 食管Wnt及Notch信號(hào)途徑的表達(dá)
　　 目的：研究BE組織中Wnt及Notch信號(hào)途徑的關(guān)鍵分子Tcf4，Cdx2，Hes1,Math1的表達(dá)。
　　 方法：用免疫組織化

5、學(xué)法測(cè)定41例BE組織和其配對(duì)的正常食管鱗狀上皮組織中Tcf4，Cdx2，Hes1,Math1的蛋白表達(dá)，同時(shí)采用Real-timePCR法測(cè)定mRNA的表達(dá)，計(jì)算△△CT值，并分析指標(biāo)間的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：Tcf4，Cdx2，Hes1，Math1的表達(dá)在腸化組高于非腸化，高度及低度異型增生組高于無(wú)異型增生組，在C≥3Mn組高于其他。mRNA的表達(dá)Tcf4與Cdx2、Hes1、Math1正相關(guān)，Hes1與Math1、Cdx2

6、正相關(guān)，Cdx2與Math1正相。
　　 結(jié)論：BE組織存在與小腸增殖分化相關(guān)的Wnt及Notch信號(hào)途徑關(guān)鍵分子的表達(dá)，其表達(dá)與BE的腸化、異型增生及長(zhǎng)度密切相關(guān)。
　　 第二部分：人正常食管上皮原代細(xì)胞的提取分離、鑒定及培養(yǎng)
　　 目的：探討人正常食管上皮原代細(xì)胞的提取分離、鑒定及培養(yǎng)的方法，以獲得一定量的純度高的細(xì)胞，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：人食管上皮細(xì)胞來源于食管部分切除手術(shù)患者的正常

7、食管組織，先后經(jīng)Dispase Ⅱ和胰酶消化，從食管黏膜上分離上皮細(xì)胞，和波絲蛋白抗體免疫組織化學(xué)染色共同鑒定細(xì)胞，無(wú)血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基（K-SFM）培養(yǎng)細(xì)胞。采用直接觀察，臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行活力鑒定及細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　 結(jié)果：細(xì)胞呈典型“鋪路石”狀排列，CK13抗體免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性，波絲蛋白抗體免疫組織化學(xué)染色陰性，證明培養(yǎng)的細(xì)胞為人食管上皮細(xì)胞，無(wú)間質(zhì)細(xì)胞污染。細(xì)胞倍增天數(shù)為1.179d，細(xì)胞群體倍增時(shí)間(p

8、opulation doubling time，PDT)為49.42h。
　　 結(jié)論：Dispase Ⅱ消化分離細(xì)胞，K-SFM培養(yǎng)細(xì)胞可獲得一定量的純度高的人食管鱗狀上皮細(xì)胞。
　　 第三部分：酸對(duì)人正常食管上皮細(xì)胞的影響
　　 目的：探討不同pH值的酸孵育后人正常食管鱗狀上皮細(xì)胞的形態(tài)變化及Tcf4，Cdx2，Hes1,Math1的表達(dá)
　　 方法：體外培養(yǎng)人正常食管粘膜上皮細(xì)胞，分別在pH 4.0、

9、pH 5.0、pH 6.0的培養(yǎng)液中每天3次，每次10 min 孵育，共7天。并設(shè)對(duì)照組進(jìn)行比較。采用倒置顯微鏡細(xì)胞大體形態(tài)變化，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖速率，電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，CK13和CK20抗體熒光染色觀察細(xì)胞角蛋白表達(dá)的變化，Real-time PCR方法檢測(cè)Tcf4，Cdx2，Hes1,Math1 mRNA的表達(dá)，Western-blot方法檢測(cè)Tcf4，Cdx2，Hes1,Math1蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：①

10、pH 4.0組5d和7d細(xì)胞增殖速率低于其他實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組（P<0.05）。（②電鏡下細(xì)胞無(wú)明顯超微結(jié)構(gòu)的改變。③CK13和CK20抗體熒光染色觀察細(xì)胞角蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化；④pH 4.0組細(xì)胞Tcf4，Cdx2 mRNA的表達(dá)于5d和7d時(shí)高于其他組（P<0.05）。⑤pH 4.0組細(xì)胞Tcf4，Cdx2 蛋白的表達(dá)于5d和7d時(shí)高于其他組（P<0.05）。
　　 結(jié)論：pH 4.0條件下人正常食管黏膜上皮細(xì)胞增殖速率降低

11、，Tcf4，Cdx2mRNA及蛋白表達(dá)水平升高。
　　 第四部分：膽汁酸對(duì)人正常食管上皮細(xì)胞的作用
　　 目的：探討不同濃度的膽汁酸孵育后人正常食管鱗狀上皮細(xì)胞的形態(tài)變化及Tcf4，Cdx2，Hes1,Math1的表達(dá)
　　 方法：體外培養(yǎng)人正常食管粘膜上皮細(xì)胞，分別在含有濃度分別為250umol、400 umol和500 umol膽汁酸的培養(yǎng)液中每天3次，每次10 min 孵育，共7天。并設(shè)未加膽汁酸的空白對(duì)照

12、組進(jìn)行比較。采用倒置顯微鏡細(xì)胞大體形態(tài)變化，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖速率，電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，CK13和CK20抗體熒光染色觀察細(xì)胞角蛋白表達(dá)的變化，Real-time PCR方法檢測(cè)Tcf4，Cdx2，Hes1,Math1 mRNA的表達(dá)，Western-blot方法檢測(cè)Tcf4，Cdx2，Hes1,Math1蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：①5d和7d時(shí)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖速率低于對(duì)照組。②電鏡下400 umol組細(xì)胞7d后可見張

13、力纖維減少，少數(shù)細(xì)胞見類似于腺體的超微結(jié)構(gòu)變化。③熒光染色見400 umol組細(xì)胞7d CK20蛋白表達(dá)；④400 umol孵育組的人正常食管黏膜上皮細(xì)胞Tcf4，Cdx2，Hes1,Math1mRNA的表達(dá)于7d時(shí)高于其他組（P<0.05）。⑤400 umol孵育組的人正常食管黏膜上皮細(xì)胞Tcf4，Cdx2，Hes1,Math1蛋白的表達(dá)于7d時(shí)高于其他組（P<0.05）。
　　 結(jié)論：不同濃度的膽汁酸降低人正常食管上皮細(xì)胞增

14、殖速率；含有濃度為400 umol膽汁液的培養(yǎng)液中孵育的人正常食管上皮細(xì)胞部分可出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)的改變，角蛋白表達(dá)發(fā)生變化，Tcf4，Cdx2，Hes1,Math1mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高。
　　 第五部分：酸及膽汁酸的混合物對(duì)人正常食管上皮細(xì)胞的影響
　　 目的：探討酸及膽汁酸的混合物孵育后人正常食管鱗狀上皮細(xì)胞的形態(tài)變化及Tcf4，Cdx2，Hes1,Math1的表達(dá)
　　 方法：體外培養(yǎng)人正常食管粘膜上皮

15、細(xì)胞,在pH值為4.0、膽汁酸濃度為400uml的培養(yǎng)液中每天3次，每次10 min 孵育，共7天。設(shè)未加酸及膽汁酸混合物的空白對(duì)照組、pH4.0組及含400 umol濃度膽汁酸組3組進(jìn)行比較。采用倒置顯微鏡細(xì)胞大體形態(tài)變化，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖速率，電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，CK13和CK20抗體熒光染色觀察細(xì)胞角蛋白表達(dá)的變化，Real-time PCR方法檢測(cè)Tcf4，Cdx2，Hes1,Math1 mRNA的表達(dá)，Wester

16、n-blot方法檢測(cè)Tcf4，Cdx2，Hes1,Math1蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：①7d時(shí)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖速率低于對(duì)照組，混合組細(xì)胞增殖速率低于400umol組。②電鏡下細(xì)胞無(wú)明顯超微結(jié)構(gòu)的改變。③7d時(shí)混合組細(xì)胞可見微弱的CK20的表達(dá)。④7d時(shí)混合物組Tcf4，Cdx2 mRNA的表達(dá)高于未加空白對(duì)照組（P<0.05），低于pH4.0組及400 umol濃組（P<0.05）；7d時(shí)混合物組Hes1,Math1 mRNA的

17、表達(dá)高于對(duì)照組和pH4.0組（P<0.05），低于400 umol組（P<0.05）。⑤7d時(shí)混合物組Tcf4，Cdx2蛋白的表達(dá)高于未加空白對(duì)照組（P<0.05），低于pH4.0組及400 umol組（P<0.05）；7d時(shí)混合物組Hes1,Math1 蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組和pH4.0組（P<0.05），低于400 umol組（P<0.05）。
　　 結(jié)論：酸及膽汁酸聯(lián)合作用降低人正常食管上皮細(xì)胞增殖速率，對(duì)細(xì)胞增殖速率的影響

18、強(qiáng)于膽汁酸。酸及膽汁酸混合組Tcf4，Cdx2，Hes1,Math1mRNA及蛋白表達(dá)水平升高，但表達(dá)低于膽汁酸。
　　 本研究結(jié)果提示BE組織中存在Wnt及Notch信號(hào)途徑的關(guān)鍵分子Tcf4，Cdx2，Hes1,Math1的異常表達(dá)。人食管正常鱗狀上皮細(xì)胞在pH4.0的條件下Tcf4，Cdx2呈高表達(dá)。人食管正常鱗狀上皮細(xì)胞在含有濃度為400 umol膽汁液的培養(yǎng)液中孵育，Tcf4，Cdx2，Hes1,Math1的表達(dá)升高。