MAP4上調Dynlt1減輕缺氧早期心肌線粒體通透性轉換的作用及機制研究.pdf

1、燒傷早期出現(xiàn)的心肌細胞骨架損傷可能是燒傷后細胞能量代謝障礙的重要機制之一。本課題組以往的系列研究表明，細胞骨架的形態(tài)結構和功能正常與否對胞內線粒體功能和細胞能量代謝具有直接而重要的影響。因此，我們提出了從細胞骨架的調控入手，尋找微管與線粒體間的橋梁分子，減輕缺氧后線粒體通透性轉換，改善心肌細胞能量代謝的思路。研究發(fā)現(xiàn)，過表達MAP4有助于維持缺氧心肌細胞微管的穩(wěn)定，明顯改善缺氧早期(Hypoxia＜3h)心肌細胞ATP和能荷水平，維持細

2、胞活力，改善和維持缺氧早期心肌細胞能量代謝及生理活性。
　　應用酵母雙雜交技術，我們篩選出與線粒體外膜MPTP主要成分VDAC(VDAC1)可能存在相互作用的新蛋白質分子——動力蛋白輕鏈1，認為Dynlt1可能是微管(MT)對線粒體通透性轉換孔(MPTP)進行調控作用的中間橋梁分子，其具體結構方式為：MitoVDAC-Dynlt1/Dynein-MT。
　　本課題旨在研究Dynlt1通過穩(wěn)定VDAC，進而減輕缺氧早期線粒體通

3、透性轉換，以證明“細胞骨架在缺氧心肌細胞能量代謝障礙中具有重要作用”的假設。
　　材料與方法:
　　1、以免疫組化雙標記、co-IP等技術手段，觀察體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞和HeLa細胞中Dynlt1及VDAC表達定位，并驗證在哺乳動物細胞中Dynlt1-VDAC、Dynlt1-MT是否存在相互作用。進一步觀察破壞微管結構之后，Dynlt1的分布變化規(guī)律及與微管的關系。
　　2、用包含MAP4基因的重組腺病毒載體，轉

4、染HeLa細胞。激光共聚焦掃描顯微鏡觀察過表達MAP4對細胞微管的穩(wěn)定作用，并觀察此過程中Dynlt1的表達變化，應用MTT法檢測細胞活力，四甲基羅丹明乙酯(TMRE)觀察線粒體膜電位(ΔΨ)，酯化鈣黃綠素(Calcein-AM)觀察MPTP開放程度。進而明確過表達MAP4可以穩(wěn)定微管，同時Dynlt1含量增加可減輕缺氧早期線粒體通透性轉換。
　　3、以Dynlt1 shRNA Plasmid轉染HeLa細胞，形成穩(wěn)定轉染的細胞克

5、隆，構建持續(xù)低表達Dynlt1的細胞株HeLa-dD。運用MTT、TMRE、Calcein-AM等手段觀察低表達Dynlt1后，細胞相對活力、ΔΨ、MPTP開放程度，以及在此條件下過表達MAP4之后對細胞活力的影響。
　　主要結果與結論:
　　1.胞漿中Dynlt1與MT、Dynlt1與VDAC有著明顯的共區(qū)域分布特征，大量Dynlt1沿微管結構區(qū)域伴行分布，常氧下VDAC幾乎都與Dynlt1有密切共定位。Dynlt1分子與

6、細胞中的微管結構在空間分布上具有緊密關系，同時Co-IP證明Dynlt1與VDAC具有確切的蛋白質相互作用，提示兩者在功能方面有密切的相互影響。
　　2.胞內Dynlt1的分布因微管的破壞而變化，微管破壞的同時使Dynlt1分子從微管上脫落，并且隨著缺氧時間延長，Dynlt1分子脫落的程度加劇。說明微管與Dynlt1在結構分布和其所發(fā)揮作用的時空上具有密切的關系。缺氧使線粒體受破壞，線粒體外膜的VDAC也因線粒體的破壞而含量減少。

7、提示Dynlt1與VDAC在胞漿中有廣泛結合。
　　3. MAP4過表達可以確切的維護缺氧早期細胞活力，并減輕缺氧所致的微管結構破壞；可以維護細胞線粒體膜電位，減少線粒體通透性轉變；過表達MAP4可以上調Dynlt1的表達，且這一作用非常強烈。
　　4.穩(wěn)定轉染Dynlt1 shRNA慢病毒質粒，形成了持續(xù)低表達Dynlt1的細胞株HeLa-dD。在此基礎上初步探討了“Dynlt1表達增強”與“MAP4改善缺氧細胞能量代謝障