OxyR對傷寒沙門菌Vi抗原的表達調(diào)節(jié).pdf

1、目的:
　　OxyR作為細菌中的重要調(diào)控子，在面對氧化應激時發(fā)揮重要作用，它可以幫助細菌抵御氧化損傷。OxyR在傷寒沙門菌中的調(diào)節(jié)機制還不是非常的全面，這次實驗我們通過基因芯片的方法篩選受OxyR調(diào)節(jié)的基因，并對其中新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控基因進行了進一步的研究。
　　方法:
　　1.傷寒沙門菌基因芯片分析oxyR對系統(tǒng)基因表達影響:
　　將傷寒沙門菌野生株和oxyR基因缺陷變異株（ΔoxyR）培養(yǎng)至OD6000.4，給予氧

2、應激(4 mmol/L H2O2)20 min后，提取細菌總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄并用熒光素Cy3-或Cy5-進行互標cDNA后，與S.Typhi基因組芯片雜交，掃描芯片并用軟件分析結(jié)果。
　　2.qRT-PCR檢測傷寒沙門菌oxyR對Vi莢膜抗原相關基因表達影響:
　　將傷寒沙門菌野生株、ΔoxyR、oxyR缺陷回補株(ΔoxyR+pBAD-oxyR)、oxR缺陷回補空質(zhì)粒株（ΔoxyR+pBAD）培養(yǎng)至OD6000.4，給予

3、氧應激(4mmol/LH2O2)20 min或不給予氧應激，提取細菌總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄并進行qRT-PCR。分析傷寒沙門菌各菌株中tviA、tviE、vexE的表達量。
　　3.酶免疫吸附法(ELISA)檢測傷寒沙門菌Vi莢膜抗原:
　　將傷寒沙門菌野生株、ΔoxyR、oxyR缺陷回補株（ΔoxyR+pBAD-oxyR）、oxyR缺陷回補空質(zhì)粒株（ΔoxyR+pBAD）各菌株培養(yǎng)至OD6000.4后，分別加入兔源抗Vi抗血清

4、和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗進行孵育，加入終止液終止反應后，通過酶標儀在450nm處檢測熒光強度來檢測菌株表面Vi抗原的表達量。
　　4.流式細胞術檢測傷寒沙門菌Vi莢膜抗原的表達:
　　將傷寒沙門菌野生株、ΔoxyR、oxyR缺陷回補株(ΔoxyR+pBAD-oxyR)、oxyR缺陷回補空質(zhì)粒株（ΔoxyR+pBAD）各菌株培養(yǎng)至OD6000.4后，分別加入兔源抗Vi抗血清和FITC標記的羊抗兔二抗進行孵育，通過流式細

5、胞儀來檢測各傷寒沙門菌菌株表面Vi抗原的表達量。
　　5.傷寒沙門菌OxyRhis6蛋白的表達和純化:
　　將構(gòu)建成功的pET28a-oxyR重組載體熱擊入E.coli JM109(DE3)，篩選出陽性菌株。將陽性菌株培養(yǎng)至OD6000.6后，加入IPTG誘導，經(jīng)過誘導后的菌株，離心取其上清通過含Ni+的親和層析柱來收集和純化蛋白。
　　6.凝膠阻滯試驗:
　　將傷寒沙門菌中純化的OxyRhis6蛋白與含tviA

6、的啟動子區(qū)域DNA片段孵育，用6％丙烯酰胺膠電泳來檢測二者的結(jié)合情況。
　　結(jié)果:
　　1.基因芯片分析結(jié)果表明，ΔoxyR相對于野生株，有64個基因發(fā)生了變化，其中發(fā)生上調(diào)基因17個，下調(diào)基因47個，包括與Vi莢膜抗原表達相關的viaB簇基因。
　　2.qRT-PCR表明，在氧應激和非氧應激下，oxyR缺陷都可以使viaB基因簇的基因表達量發(fā)生下調(diào)。
　　3.酶免疫吸附法(ELISA)檢測表明，非氧條件下傷寒沙

7、門菌oxyR缺陷能使Vi莢膜抗原的表達量發(fā)生了下調(diào)。
　　4.流式細胞術檢測進一步證實了在傷寒沙門菌中，非氧條件下oxyR可影響Vi莢膜抗原的表達。
　　5.通過原核表達成功獲取傷寒沙門菌OxyRhis6蛋白。
　　6.凝膠阻滯試驗表明OxyRhis6蛋白與tviA的啟動子區(qū)域在體外無直接結(jié)合。
　　結(jié)論:
　　在傷寒沙門菌中，非氧條件下，oxyR基因的缺陷使得viaB基因簇的表達量發(fā)生了下降;同時，oxy