水稻T-DNA插入突變體庫(kù)的篩選及與水稻穎花穎殼發(fā)育相關(guān)基因的克隆與功能分析.pdf

1、T-DNA標(biāo)簽是一種高通量的分離和克隆植物功能基因的方法，目前在擬南芥等雙子葉植物中已得到廣泛應(yīng)用，但在水稻等單子葉植物中尚處于探索階段。本文通過(guò)對(duì)4416份T1代水稻T-DNA標(biāo)簽系的篩選，對(duì)T-DNA插入產(chǎn)生的突變類型、不同性狀的突變頻率、表型突變體的篩選程序、T-DNA側(cè)翼序列的分離方法及整合特性等進(jìn)行了研究和探討；對(duì)獲得的一個(gè)穎花穎殼缺失的突變體，進(jìn)行了對(duì)應(yīng)基因的克隆、功能驗(yàn)證、表達(dá)模式分析；對(duì)一個(gè)多重穎殼突變體開展了形態(tài)學(xué)觀察

2、和初步遺傳分析。獲得的主要研究結(jié)論有： 1、對(duì)以中花11(ZH11)、中花15(ZH15)為受體親本構(gòu)建的4416份T1代標(biāo)簽系進(jìn)行了表型鑒定，發(fā)現(xiàn)存在擬純合突變和系內(nèi)分離突變兩種類型；突變表型涉及株高、生育期、葉形、葉色、分蘗力、植株松緊度、穗頸節(jié)、穗形、穎花、粒形、類病變、雄性不育、生長(zhǎng)極性等14類性狀。其中，株高、生育期、葉色、雄性不育等性狀有著相對(duì)較高的突變頻率(＞1％)，株高和葉色的突變頻率在品種及年度間表現(xiàn)穩(wěn)定，而生

3、育期、雄性不育波動(dòng)較大，表明這類性狀的表型易受環(huán)境影響。通過(guò)T1、T2連續(xù)世代的共分離分析，初步篩選出3個(gè)與穗部或穎花發(fā)育相關(guān)的T-DNA插入突變體，其頻率約為1.37‰。為分離相關(guān)功能基因奠定基礎(chǔ)。 隨機(jī)選擇42份有表型突變的標(biāo)簽系，通過(guò)質(zhì)粒拯救和TAIL-PCR的方法，從39個(gè)標(biāo)簽系中分離獲得40條T-DNA側(cè)翼序列，其中26條為載體序列，14條與水稻基因組有很好的同源性，Blastn分析結(jié)果表明T-DNA有優(yōu)先整合進(jìn)植物功

4、能基因內(nèi)部的特性。 建立的質(zhì)粒拯救和TAIL-PCR兩種分離T-DNA側(cè)翼序列的方法，相比較而言，前者對(duì)某個(gè)特定標(biāo)簽系，篩選含有T-DNA側(cè)翼序列的陽(yáng)性克隆獲得率及測(cè)序效率較高，分離片段較長(zhǎng)，但對(duì)DNA質(zhì)量要求較高，操作過(guò)程繁瑣，工作量較大；而后者對(duì)大規(guī)模分離側(cè)翼序列、建立側(cè)翼序列庫(kù)而言擴(kuò)增效率較高，且操作簡(jiǎn)單、方便、快捷，但就某個(gè)特定標(biāo)簽系特異PCR產(chǎn)物的獲得率相對(duì)較低，且分離的序列片段一般長(zhǎng)度較短。兩種方法結(jié)合使用，對(duì)某個(gè)特

5、定標(biāo)簽系其側(cè)翼序列的分離就會(huì)有很大的幾率。 2、對(duì)一個(gè)初步確認(rèn)的穎花穎殼退化的T-DNA插入突變體(degeneratedhull1，dh1)，開展了基因克隆和功能分析研究。解剖鏡觀察結(jié)果表明dh1突變體表現(xiàn)為大部分穎花(≈70％)的內(nèi)、外稃缺失，同時(shí)伴有雌雄蕊數(shù)目的異常，少量穎花(≈30％)的內(nèi)、外稃表型正常，但雌雄蕊發(fā)育畸形。掃描電鏡和石蠟切片的結(jié)果顯示dh1突變體能進(jìn)行正常的幼穗苞原基、一次枝梗和二次枝梗的分化和發(fā)育，進(jìn)入

6、穎花器官分化后，部分穎花雖然能分化出護(hù)穎，卻在內(nèi)、外稃的分化上表現(xiàn)為功能的缺失：部分穎花內(nèi)、外稃發(fā)育提前終止或滯后于雌雄蕊的發(fā)育，部分穎花表現(xiàn)出不均衡分裂而產(chǎn)生數(shù)目異常的雄蕊，部分穎花雌蕊異常發(fā)育而呈現(xiàn)多柱頭或2朵小花的雌雄蕊器官分化后融合在一起的異?，F(xiàn)象。上述結(jié)果表明DH1基因?qū)Ψf花內(nèi)外稃的形態(tài)建成具有重要作用，同時(shí)與雌雄蕊的分化、發(fā)育也相關(guān)。 Southernblotting結(jié)果顯示T-DNA在dh1突變體中僅有1個(gè)拷貝。通

7、過(guò)TAIL-PCR的方法，獲得了全長(zhǎng)361bp的T-DNA側(cè)翼序列，Blastn結(jié)果顯示其對(duì)應(yīng)于粳稻日本晴第2染色體的PAC克隆“P0474F11”的一段序列，基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示T-DNA插入到了距一個(gè)預(yù)測(cè)功能基因的、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游283bp的位點(diǎn)。通過(guò)T-DNA序列的特異引物與T-DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)的基因組引物的不同配對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證了側(cè)翼序列與突變表型共分離。在幼穗分化期取樣進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果顯示dh1突變體目標(biāo)候選基因

8、(DH1)的轉(zhuǎn)錄水平較野生型明顯降低。因而，初步確認(rèn)T-DNA片段插入到目標(biāo)基因DH1的啟動(dòng)子附近或重要調(diào)節(jié)序列之中，而產(chǎn)生了功能喪失突變。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，DH1編碼的氨基酸序列含有保守的LOB(Lateralorganboundaries)結(jié)構(gòu)域，同時(shí)能形成卷曲螺旋(Coiledcoil)二級(jí)結(jié)構(gòu)，為典型的LBD(LOBdomaingenes)基因家族成員。 對(duì)DH1基因的RNAi可部分再現(xiàn)dh1突變體的表型，功能互補(bǔ)試驗(yàn)

9、則表明野生型DH1基因能恢復(fù)dh1突變體的表型，從而對(duì)DH1基因的功能進(jìn)行了可靠驗(yàn)證。DH1基因的原位過(guò)量表達(dá)，可導(dǎo)致產(chǎn)生植株矮小、穗軸和枝梗變短、葉片下垂等表型，與擬南芥中部分LBD基因過(guò)量表達(dá)的表型具有相似性。通過(guò)構(gòu)建pDH1：：GFP的融合表達(dá)載體，研究目標(biāo)基因的表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DH1不僅具有僅在腋芽和幼穗中表達(dá)，而不在根、葉、節(jié)或節(jié)間等器官中表達(dá)的空間特性，同時(shí)還有在幼嫩器官中較強(qiáng)表達(dá)、而在發(fā)育成熟器官中減弱表達(dá)的時(shí)間特性。

10、 dh1突變體在長(zhǎng)光照條件下抽穗比在短光照條件下抽穗有更嚴(yán)重的穎花穎殼缺失。對(duì)DH1基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行信號(hào)調(diào)控元件分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在大量的光調(diào)控元件，從而暗示有兩種可能：一是DH1基因在長(zhǎng)光照條件下表達(dá)量相對(duì)較低，T-DNA插入進(jìn)一步下調(diào)其表達(dá)，而產(chǎn)生較明顯的突變表型；而在短光照條件下，DH1基因表達(dá)量相對(duì)較高，T-DNA插入盡管下調(diào)其表達(dá)，但仍有一定的絕對(duì)表達(dá)量，因而其對(duì)穎花穎殼及其內(nèi)部器官的分化影響較小，突變表型相對(duì)較輕。

11、二是DH1基因的表達(dá)受長(zhǎng)光照條件的誘導(dǎo)，T-DNA插入下調(diào)其表達(dá)，產(chǎn)生穎花穎殼退化表型：同時(shí)，短光照條件可誘導(dǎo)與DH1功能冗余的相關(guān)基因的表達(dá)，能夠部分補(bǔ)償DH1喪失突變的功能，從而使dh1突變體在短光照條件下能夠部分恢復(fù)正常表型。 大多數(shù)已克隆的控制穎花器官發(fā)育的基因均屬于MADS-box基因家族。選擇與水稻穎花器官發(fā)育相關(guān)的5個(gè)MADS-box基因進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果顯示其在dh1突變體與野生型對(duì)照中的表達(dá)完全一致，初

12、步揭示DH1基因可能涉及了非MADS-box基因的功能信號(hào)途徑而參與對(duì)穎花構(gòu)成器官的發(fā)育調(diào)控。 本研究克隆的DH1基因，是一個(gè)典型的LBD基因，這是在水稻上首次證明LBD基因參與水稻穎花的發(fā)育調(diào)控，該基因的克隆及功能驗(yàn)證對(duì)闡明和豐富水稻穎花發(fā)育的分子調(diào)控理論具有重要意義。同時(shí)，穎花的發(fā)育是水稻產(chǎn)量、品質(zhì)形成的基礎(chǔ)。了解DH1與其它控制穎花器官發(fā)育基因的相互作用，將為提高稻谷產(chǎn)量、改進(jìn)稻米品質(zhì)提供理論依據(jù)。此外，本研究通過(guò)T-DN

13、A標(biāo)簽方法成功分離了DH1基因，為在水稻等單子葉植物的功能基因組分析中大規(guī)模應(yīng)用該技術(shù)提供了試驗(yàn)論證。 3、從T-DNA插入突變體庫(kù)中篩選獲得一個(gè)多重穎殼突變體(multipleglumes，mg)。解剖鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)外稃伸長(zhǎng)，同時(shí)伴有類穎殼狀結(jié)構(gòu)而普遍呈現(xiàn)多重穎殼；14.27％的穎花沒(méi)有雌、雄蕊，23.72％的穎花包含有額外小花，62.01％的穎花其雌、雄蕊數(shù)目異常，分別變化在1-3枚和1-9枚之間，部分穎花的花絲基部可看

14、到泡狀透明瘤狀物；突變體漿片稃片化而使其穎花在自然條件下不能開放，完全雄性和雌性不育。掃描電鏡和石蠟切片結(jié)果觀察揭示其幼穗苞原基、一次枝梗和二次枝梗原基分化正常，但進(jìn)入穎花分化后，其雌、雄蕊原基的分化較遲，會(huì)繼續(xù)進(jìn)行類似多重穎殼狀器官的分化；同時(shí)，穎花原基進(jìn)行不均衡分裂，產(chǎn)生數(shù)目不等的雌、雄蕊。遺傳分析顯示該突變是一個(gè)單基因控制的隱性性狀，并與T-DNA插入表現(xiàn)共分離。推斷其是E類基因引起的功能突變。在獲得側(cè)翼序列并驗(yàn)證其與突變表型共分