鼻息肉成纖維細胞在常氧與低氧環(huán)境下的原代培養(yǎng)及鑒定.pdf

1、目的:探討人鼻息肉的成纖維細胞在常氧與低氧環(huán)境下的細胞原代培養(yǎng)及鑒定，以備下一步為研究鼻息肉成纖維細胞的相關實驗研究提供比較優(yōu)良的細胞系，及后續(xù)實驗研究人鼻息肉的成纖維細胞的生物學特性。
　　方法:取山東大學齊魯醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科2012年10月～2013年3月的住院患者，經行鼻內鏡下鼻息肉切除手術的息肉組織共20例。取出息肉后立即將息肉標本放入4℃的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)中，在超凈臺上培養(yǎng)皿中用PBS溶液反復沖洗、浸

2、泡息肉組織，去除組織內的紅細胞及分泌物。將洗好息肉組織剪成1～2mm大小的組織塊后，分成2份轉移到準備好的EP管中，分別把1ml的0.1％Ⅰ型膠原蛋白酶和1ml的dispaseⅡ酶放入2個EP管中消化過夜。次日取出組織后，放入10ml的離心管中用移液槍輕輕吹打消化后的組織，分離出更多的細胞。分別對2種酶消化后得到的細胞進行計數后，移入60mm培養(yǎng)皿中，加入組織培養(yǎng)液（DMEM+10％胎牛血清+100mg/L鏈霉素+1×105U/L青霉素

3、）后，分別放在常氧與低氧環(huán)境下進行細胞原代培養(yǎng)。（常氧原代培養(yǎng)是以普通空氣作為培養(yǎng)箱內的混合氣體，控制氧體積分數含量為20％;低氧原代培養(yǎng)則是利用氮氣作為培養(yǎng)箱內的混合氣體，調控氧體積分數含量至5％。二種原代培養(yǎng)方法的其他培養(yǎng)環(huán)境均一致，都是37℃的溫度，相對飽和濕度和含體積分數為5％的CO2。）利用倒置相差顯微鏡，在鏡下觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)、生長繁殖狀況、有無污染。最后對人鼻息肉成纖維細胞的形態(tài)學進行初步形態(tài)學的鑒定后，再用波形蛋白單克

4、隆抗體對培養(yǎng)后的原代細胞行免疫組化染色鑒定。用CCK-8比色法檢測成纖維細胞的增殖變化，描繪其生長曲線。
　　結果:dispaseⅡ酶消化組的細胞數目明顯高于Ⅰ型膠原酶消化組，兩組之間的差異有統計學意義(P＜0.05)。可以從人鼻息肉組織中分離出成纖維細胞，對其進行原代培養(yǎng)后，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)呈梭形、星形、不規(guī)則形或多突的紡錘形，胞核較大呈圓形或橢圓形，細胞胞質向外突出，一般有2～3個長短不齊的觸角，細胞中央有卵圓

5、形細胞核。在細胞密度高時，細胞之間的排列方式多為平行排列，或呈放射狀、漩渦狀排列。對本實驗中培養(yǎng)的細胞進行波形蛋白單克隆抗體免疫組化染色，免疫組化染色后細胞內出現棕色或棕褐色的標志物者為陽性細胞，證實其為成纖維細胞。在常氧及低氧環(huán)境下培養(yǎng)的人鼻息肉成纖維細胞的生長曲線無明顯差異。
　　結論:經dispaseⅡ酶消化的組織細胞數目較多，是一種較好獲得組織細胞的技術方法。本實驗中在常氧及低氧環(huán)境下，均可建立比較穩(wěn)定、可靠的人體鼻腔鼻黏