miR-29c在鵝肥肝形成中的表達與功能研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，主要通過與靶基因的3'UTR區(qū)結合使靶基因的mRNA翻譯受到抑制或直接降解，從而調控發(fā)育、代謝和癌癥等生物過程，是基因表達的重要調控因子。肝臟是脂肪酸合成的主要場所，在動物的脂質代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)miR-29c可以調控肝臟的纖維化，并且在抑制肝癌細胞轉移等方面發(fā)揮重要作用。然而，在脂肪肝形成過程中miR-29c的表達與調控以及其功能尚不清

2、楚。本實驗對此進行較深入的研究，主要結果如下:
　　1、填肥抑制了miR-29c在肝臟、胸肌和腹脂中的表達。本研究利用實時熒光定量技術測定了填肥朗德鵝與對照朗德鵝（常規(guī)飼養(yǎng)）胸肌、腹脂和肝臟中的miR-29c表達水平。結果顯示，填肥顯著抑制了這些與脂肪代謝相關組織中的miR-29c的表達，提示其在鵝肝臟脂肪代謝過程中扮演重要角色。
　　2、miR-29c的靶基因預測與篩選。依據(jù)雞鵝miR-29c種子序列的保守性，參考雞的基因

3、組序列，利用生物信息學軟件miRDB、TargetScan、和Microcosm預測miR-29c的靶基因，兩兩取交集并參考已有文獻篩選得到COL3A1、SGK1、INSIG1、DDX3X、PPM1D、TNFAIP3共6個靶基因。然后，通過對預測靶基因的定量驗證發(fā)現(xiàn)COL3A1、SGK1、INSIG1三個靶基因在填飼后朗德鵝肝臟中的表達量顯著上調，DDX3X、PPM1D、TNFAIP3的表達則未出現(xiàn)顯著上調。依據(jù)miRNA通常與其靶基因

4、表達量相反，我們推定COL3A1、SGK1和INSIG1最有可能是miR-29c靶基因。
　　3、miR-29c的靶基因驗證。首先，設計候選靶基因3'UTR序列特異性引物進行PCR擴增，經(jīng)克隆測序獲得擴增產物的序列。再利用pMIR-REPORT分別構建靶基因3'UTR靶序列區(qū)的表達載體，同時依據(jù)獲得的鵝miR-29c成熟序列設計其模擬物用于靶向關系的驗證。最后，通過在非肝細胞系CHO中建立的雙熒光素酶系統(tǒng)驗證鵝miR-29c的三個

5、靶基因。結果表明COL3A1、SGK1和INSIG1為鵝miR-29c的靶基因。因此，miR-29c可能通過對這些基因的作用影響鵝肥肝的形成。
　　4、在鵝原代肝細胞中miR-29c對靶基因表達的影響。通過設置miR-29c過表達組、抑制組以及相應的對照組，經(jīng)肝細胞轉染實驗，以及靶基因COL3A1、SGK1、INSIG1的定量檢測，發(fā)現(xiàn)COL3A1和INSIG1的表達在鵝原代肝細胞中受到miR-29c的調控，而SGK1的表達受mi

6、R-29c的調控可能為肝細胞中的其他因子所干擾。miR-29c對COL3A1和INSIG1表達的影響更容易在miR-29c表達受到抑制時發(fā)生。
　　5、脂肪肝形成相關因子處理鵝肝細胞對miR-29c表達的影響。本研究利用不同濃度的葡萄糖、胰島素、脂肪酸分別處理鵝肝細胞以檢測對miR-29c表達的影響，結果顯示100mmol/L葡萄糖和0.5mmol/L棕櫚酸鉀均可顯著降低miR-29c的表達，但100 nmol/L胰島素和0.5m

7、mol/L油酸鈉對miR-29c表達的影響甚少。說明高糖、高脂均可以誘導鵝肥肝中miR-29c的表達，進一步說明miR-29c的表達受鵝脂肪肝形成相關因子的調控。
　　6、miR-29c介導葡萄糖對鵝肝細胞中靶基因INSIG1、COL3A1的調控。本實驗對鵝原代肝細胞進行miR-29c抑制劑轉染和葡萄糖處理，并定量檢測靶基因COL3A1、INSIG1的表達情況。結果顯示，100 mmol/L的葡萄糖能使INSIG1的表達顯著上調，

8、miR-29c抑制劑能顯著增強這種趨勢，而100 mmol/L的葡萄糖能使COL3A1的表達顯著下調，但miR-29c抑制劑能顯著抑制這種下調。這說明葡萄糖誘導的INSIG1和COL3A1的表達受到miR-29c的調控。
　　7、miR-29c的上游轉錄因子預測及初步驗證。首先設計miR-29c上游序列引物進行PCR擴增，經(jīng)克隆測序獲得上游序列。然后，通過Gene Regulation在線軟件對鵝miR-29c的上游序列進行轉錄因