抗人uPAR單克隆抗體的制備和應(yīng)用.pdf

1、上海醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文抗人uPAR單克隆抗體的制備和應(yīng)用姓名：于偉英申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：朱運(yùn)松20000501第一部分抗人尿激酶型纖溶酶原激活物受體(uPAR)單克隆抗體的制備和鑒定在本實(shí)驗(yàn)中，我們以野生型的人uPAR純品為抗原免疫BALB／C小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)獲得了一株能穩(wěn)定分泌uPARMcAb的雜交瘤細(xì)胞株，命名為9HuPAR。用9H—uPAR誘生小鼠腹水，通過(guò)SPA親和層析柱從腹水中純化得到單

2、克隆抗體，得率為3mg／ml腹水，純度達(dá)781％，ELISA法檢測(cè)效價(jià)達(dá)1：106以上。用IsoStripTM試劑盒測(cè)定其所屬亞類(lèi)為IgG，。。，分子量為150kD左右。Westernblotting結(jié)果表明uPARMcAb能特異地識(shí)別分子量為55kD的uPAR，而且其識(shí)別部位與構(gòu)象無(wú)關(guān)，親和常數(shù)為125107。用uPARMcAb對(duì)95D和95C進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)uPAR主要位于肺癌細(xì)胞表面及細(xì)胞質(zhì)中，其中具有高度侵襲和轉(zhuǎn)移特性

3、的95D中uPAR的表達(dá)水平明顯高于低侵襲和轉(zhuǎn)移特性的95C中uPAR的表達(dá)水平。用uPARMcAb對(duì)19例原發(fā)性肺癌組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，結(jié)果在17例(895％)中檢測(cè)到了與uPAR的顯色反應(yīng)，而且主要位于肺癌細(xì)胞表面及細(xì)胞質(zhì)中。將uPARMcAb以一定的終濃度加到人工基底膜中及95D和具有高侵襲特性的乳腺癌細(xì)胞株MDAMB231(M231)細(xì)胞懸液中，在Boyden小室中進(jìn)行體外侵襲和遷移能力的分析，結(jié)果顯示，經(jīng)uPARMcAb

4、處理后，95D、M231的侵襲或遷移能力明顯降低，分別下降為對(duì)照組的4840％和581％(P005)，提示此抗體在抑制腫瘤的侵襲或遷移上有一定的作用，可進(jìn)一步用于腫瘤治療的研究。第二部分尿激酶型纖溶酶原激活物及其受體在肺癌組織中的表達(dá)根據(jù)腫瘤是否涉及胸膜和，或支氣管和，或有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，將39例原發(fā)性肺癌手術(shù)標(biāo)本的石蠟切片分為侵襲轉(zhuǎn)移性和非侵襲轉(zhuǎn)移性肺癌兩組，凡涉及胸膜和，或支氣管和，或淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的標(biāo)本為侵襲轉(zhuǎn)移性肺癌(共20例)，沒(méi)

5、有這些病理改變的標(biāo)本為非侵襲轉(zhuǎn)移性肺癌(共19例)。用ABC免疫組化法對(duì)uPA及其uPAR在肺癌組織中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并按照McCarthy等報(bào)道的方法對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析，即按照細(xì)胞著色的程度分成0、1、2、3四級(jí)，分別對(duì)應(yīng)著無(wú)著色、輕度著色、明顯著色和深度著色。對(duì)于每張切片，計(jì)數(shù)100個(gè)相鄰細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)出4種著色程度細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，代表最終抗原表達(dá)程度的分值按公式∑Pii計(jì)算，其中i為細(xì)胞著色程度，取值為0、1、2、3，