氯離子通道蛋白-1(GLIC1)在結腸癌轉移中的作用及機制研究.pdf

1、背景及目的：
　　 結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，其治療目前仍以手術為主。雖然腫瘤被完全切除，但術后仍可能發(fā)生播散性轉移，術后5年生存率較低，約50％，近半數病例術后2年出現腫瘤的復發(fā)和轉移。氯離子通道蛋白-1(Chloride intracellular channel1，CLIC1)是新近發(fā)現的一種離子通道蛋白，它屬于氯通道蛋白家族中的一種，最近研究表明CLIC1在肝癌、膽囊癌和胃癌等腫瘤組織中高表達，并與膽囊癌及胃癌的轉移

2、相關，在結直腸癌中也檢測到CLIC1的高表達，但是CLIC1是否與結直腸癌的轉移有關未作相關研究。因此本課題從以下三個方面對CLIC1與結腸癌的轉移作一初步研究：
　　 (1)CLIC1在結腸癌組織及癌旁組織中的表達有無差異，CLIC1的表達結腸癌患者與患者的性別、年齡、腫瘤大小、有無淋巴結轉移及TNM分期等是否有關；
　　 (2)CLIC1能否通過調控性容積下降(RVD)介導結腸癌的轉移；
　　 (3)CLIC

3、1在缺氧-再加氧條件下與結腸癌轉移及其機制，從而為結腸癌的防治提供新的思路和方法。
　　 研究方法與結果：
　　 第一部分 CLIC1mRNA及蛋白在結腸癌表達及臨床意義
　　 方法：收集2011年1-6月本院手術切除的54例結腸癌和相應癌旁組織(距腫瘤邊緣>5cm)標本。采用逆轉錄RT-PCR檢測CLIC1mRNA在結腸癌組織及相應癌旁組織中的表達情況，免疫組化檢測CLIC1蛋白在結腸癌組織的表達。比較CLIC

4、1mRNA在結腸癌及癌旁組織的表達差異，分析CLIC1蛋白的表達與患者年齡、性別、腫瘤的大小、部位、分化程度、淋巴結轉移及TNM分期等方面的關系。
　　 結果：CLIC1mRNA在54例患者癌組織中表達的陽性率為85.18％(46/54)；在相應癌旁組織中表達的陽性率為90.74％(49/54)，兩者CLIC1mRiNA的陽性表達率之間比較無明顯差異(P>0.05)。CLIC1mRNA在結腸癌及癌旁組織中的擴增水平別為0.657

5、6±0.04.3和0.2808±0.027，兩者比較P<0.01。結腸癌組織中CLIC1蛋白的表達水平高于癌旁組織，CLIC1蛋白表達在患者腫瘤的浸潤程度(P<0.05)和有無淋巴轉移(P<0.05)存在差異；在TNM分期(P<0.01)差異有顯著性；而CLIC1蛋白表達在患者的年齡、性別、腫瘤的大小、部位、分化程度方面無明顯差異(P>0.05)。
　　 第二部分 CLIC1介導RVD促進結腸癌遷移及侵襲
　　 方法：我

6、們用人結腸癌細胞株LOVO和HT29作為細胞模型來研究氯離子通道蛋白-1(CLIC1)在結腸癌轉移中的作用。用低滲液分別刺激誘導LOVO和HT29細胞的調控性細胞容積下降(RVD)過程，比較兩者RVD的差異；然后CLIC1特異性抑制劑IAA94觀察對LOVO和HT29細胞RVD的影響。分別采用CLIC1特異性抑制劑IAA94和CLIC1SiRNA轉染，研究它們對結腸癌細胞遷移及侵襲的影響。通過RT-PCR、Western Blot及細胞

7、免疫熒光檢測CLIC1 mRNA及其蛋白的表達。
　　 結果：當兩種細胞暴露于低滲溶液時，高轉移潛能的LOVO和低轉移潛能的HT29細胞細胞，與在等滲溶液中比較細胞容積分別增J31145.6±1.8％(P<0.01)和46.8±2.3％(P<0.01)。在腫脹高峰后，細胞容積逐漸下降。LOVO細胞標準化細胞容積從峰值145.6±1.8％(低滲5分鐘)，下降至最小值109.8±3.0％(低滲17分鐘)(P<0.01)；HT29細胞

8、標準化細胞容積，從峰值146.8±2.3％(低滲5分鐘)，在低滲16分鐘下降至最小值120.5±2.1％(低滲16分鐘)(P<0.01)。HT29和LOVO細胞的RVD值分別為61.4±2.2％和81.09±1.9％，兩者比較差異有顯著性(P<0.01)。特異的氯離子通道蛋白-1阻滯劑IAA94(20或40μmol/L)可抑制結腸癌細胞的RVD、遷移和侵襲能力。這些效應呈劑量依賴性。小RNA(SiRNA)干擾下調CLIC1的表達亦可抑制

9、LOVO和HT29細胞的遷移和侵襲能力。CLIC1蛋白均主要表達在兩種類型細胞的細胞膜，表明可發(fā)揮氯離子通道功能；與HT29細胞相比，CLIC1mRNA和蛋白的表達在LOVO細胞均高表達(P<0.01)。氯離子通道蛋白-1特異阻滯劑IAA94(20或40μmol/L)對兩種細胞的CLIC1mRNA和蛋白表達水平均無明顯的影響。
　　 第三部分 CLIC1通過ROS/ERK信號通路介導結腸癌LOVO細胞的遷移及侵襲
　　

10、方法：缺氧-再加氧(H-R)培養(yǎng)處理人結腸癌LOVO細胞，熒光探針DCF-DA檢測檢測細胞內活性氧(ROS)水平，傷口愈合及Transwell細胞侵襲試驗分別檢測對LOVO細胞遷移及侵襲的影響。NADPH氧化酶抑制劑(DPI)、抗氧化劑(NAC)、ERK抑制劑(PD98059)及氯離子通道蛋白-1抑制劑(IAA94)分別處理H-R條件下LOVO細胞，檢測對細胞ROS產生、遷移及侵襲的影響，Western blot檢對ERK、p-ERK、

11、MMP-2及MMP-9蛋白表達的影響。
　　 結果：與常氧培養(yǎng)組(N)比較，H-R處理后LOVO細胞內的ROS明顯提高(P<0.01)，細胞的遷移及侵襲能力明顯增強(分別P<0.05，P<0.01)，P-ERK、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯上調。與H-R組比較，DPI(15μmol/L)組；NAC(30mmol/L)組；PD98059(50μmol/L)組或IAA94(20和40μmol/L)組細胞ROS產生、遷移及侵

12、襲能力明顯減弱(P<0.01)，p-ERK、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平亦明顯減少。
　　 全文結論：
　　 (1)CIAC1mRNA及其蛋白在結腸癌組織中高表達，CLIC1蛋白表達在腫瘤的浸潤程度、有無淋巴轉移和TNM分期方面存在顯著差異；而在患者的年齡、性別、腫瘤的大小、部位、分化程度方面差異無顯著性。
　　 (2)RVD與結腸癌細胞的轉移潛能有關；CLIC1特異性抑制劑IAA94抑制結腸癌LOVO及H