TALENs介導的山羊BLG基因敲除和hLF基因敲入的研究.pdf

1、TALENs技術是最近幾年來迅速發(fā)展起來的基因靶向修飾技術，該技術能夠簡單、高效的在目標靶基因位點處產(chǎn)生多種突變效應，現(xiàn)已被廣泛應用于各種動植物細胞及個體的基因修飾研究中。與經(jīng)典的基因打靶技術相比，TALEN核酸酶在與基因打靶載體的共同作用下，具有“一步法”完成目標基因的敲除和外源基因定點敲入的優(yōu)勢。本研究通過利用TALENs基因編輯技術和hLF基因打靶載體在山羊BLG基因第一外顯子起始密碼子附近敲除目標靶序列，并在敲除位點引入人乳鐵蛋

2、白基因，從而降低山羊乳汁中對人具有致敏作用的β-乳球蛋白的含量，提高羊奶的營養(yǎng)和消費價值。
　　本研究的目的是應用TALENs技術與山羊β-乳球蛋白調(diào)控序列，PCR擴增獲得的hLF cDNA基因序列，人巨細胞病毒啟動/增強子(Pcmv)和SV40 poly A以及HSV-TK的負篩選基因等元件，構建含新霉素抗性篩選基因(Neo)的乳腺特異性表達hLF的基因打靶載體。用構建獲得的TALENs和乳腺特異性打靶載體轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞

3、，篩選獲得轉(zhuǎn)基因單克隆細胞株，并通過體細胞核移植技術制備在BLG基因上定點敲入hLF的轉(zhuǎn)基因山羊。移植受體并通過懷孕出生的轉(zhuǎn)基因山羊，用來培育新一代高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)不含對人致敏的，并富含對人體有益的人乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因乳用奶山羊新品系。
　　山羊β-乳球蛋白基因(BLG)位于11號染色體，全長8088bp，編碼BLG的轉(zhuǎn)錄單元長4698bp，5'端非翻譯區(qū)2148bp，3'端非翻譯區(qū)1242bp，含有七個外顯子，六個內(nèi)含子。本研究設計實驗，按

4、照已有報道的TALENs設計原則，以山羊BLG基因序列為模板設計TALENs，在第一外顯子ATG-2189起始密碼子附近選取2條靶序列，作為指導構建TALENs表達載體的靶向識別序列。選取與靶序列相對應的識別雙殘基模塊和骨架載體，經(jīng)過連接、轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定，最終獲得2對TALEN表達載體(TALEN-L12/TALEN-R12、TALEN-L18/TALEN-R18)，TALENs表達載體的構建為TALENs活性鑒定及BLG基因定點修飾

5、的研究奠定基礎。
　　為了獲得能夠在山羊乳腺中特異性高效表達人乳鐵蛋白的載體，本研究以山羊BLG基因為模板，PCR分別擴增出山羊5'調(diào)控序列1035 bp和3'調(diào)控序列1826bp，再以本實驗室保存的BLC14為基礎，載體包括5'調(diào)控序列、CMV啟動/增強子、hLF cDNA基因序列、SV40polyA啟動/增強子、Neo基因和3'調(diào)控序列，并通過PCR擴增的方法獲得其功能基因序列，然后連接上述BLG調(diào)控序列，鑒定插入序列的正反向

6、，挑取正確的載體。在確定正確的乳腺特異性基因表達載體之后，通過酶切線性化，再與實驗室保存的含有一個HSV-TK的負篩選基因序列相連接，從而獲得本實驗需要的乳腺特異性表達hLF的基因打靶載體，并命名為BLTF-7-82。
　　基因打靶載體BLTF-7-82與TALEN-18L/18R質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染30日齡原代山羊胎兒成纖維細胞，細胞轉(zhuǎn)染三天后通過藥物對進行篩選。所用藥物濃度為G418(800μg/mL)和GCV(10μg/mL)，正負篩

7、選維持7-14天，挑取細胞6孔板上生長狀況良好的細胞克隆株，傳代到24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，此時藥物正負篩選的濃度降低一半，最終獲得藥物抗性胎兒成纖維細胞125株。將篩選獲得的陽性細胞進行消化，并應用特異性引物進行整合情況的檢測。首先用引物cmv-1/cmv-2對人乳鐵蛋白和CMV基因進行整合檢測，PCR產(chǎn)物大小為775bp，能擴增出目的條帶的樣品則為整合hLF的陽性細胞株，獲得整合細胞株89株。之后將整合hLF的陽性細胞株的單克隆細胞株基因

8、組，再分別用引物5farcmv-1/5far cmv-2和neo3far-1/neo3far-2對其進行定點整合檢測，PCR產(chǎn)物大小分別為1703 bp和3604bp，同時擴增出上述兩個條帶，才能確定為在BLG基因上定點整合人乳鐵蛋白外源基因的陽性細胞株，根據(jù)PCR檢測與序列比對結果最終確定1株細胞為定點整合hLF外源基因的陽性細胞株，其基因打靶效率約為1.5×10-6。
　　同源重組檢測顯示該細胞株為在山羊BLG基因座上雙等位定