基于3D細胞培養(yǎng)的肺癌類干細胞的分離和鑒定.pdf

1、目的:本研究建立細胞3D培養(yǎng)方法以分離和鑒定肺癌類干細胞，并與2D培養(yǎng)方法比較，初步探討該方法在評價肺癌體外增殖、凋亡、侵襲和藥物反應性方面的應用。
　　方法:
　　1.3D細胞培養(yǎng)方法的建立
　　將人肺腺癌細胞系A549以104個/孔的細胞與RPMI1640和BME為基礎的培養(yǎng)基制成細胞懸液，培養(yǎng)7天，用分散酶和回收液消化并將細胞回收傳代，進行類干細胞篩選，收集細胞進行流式細胞儀檢測干細胞表型。收集各組培養(yǎng)3、7、1

2、1、14、20天的細胞，分別制成細胞懸液，調整細胞濃度為1×105個細胞/100μl，分別用抗體標記物(CD44、CD326、CD24)標記，同時標記FITC-IgG2b、APC-IgG1、PE-IgG1作為對照進行流式細胞儀免疫表型檢測。
　　2.肺癌干細胞功能檢測
　　將3D培養(yǎng)的A549細胞進行體外成球、耐藥性、體內成瘤及類干細胞鑒定，并與2D培養(yǎng)的細胞進行比較。將各組培養(yǎng)的細胞以5000個/3ml MFM的密度接種到

3、6孔板中，7天后觀察細胞的成球率。分別接種數(shù)目為5×104個細胞/只接種到SCID裸鼠體內，每組4只。每三天測量瘤塊大小，并繪制生長曲線。并且利用Matrigel和Transwell構建侵襲小室進行高侵襲性和低侵襲性細胞群的分離，利用劃痕修復實驗檢測細胞遷移能力。通過實時定量PCR檢測兩組肺癌干細胞相關基因表達水平的變化。
　　3.3D細胞培養(yǎng)在抗癌藥藥效學方面的應用
　　再將兩組培養(yǎng)的A549細胞通過MTT檢測各組細胞的順

4、鉑耐藥性的變化，并通過Western blot檢測兩組肺癌類干細胞相關蛋白表達水平的變化。
　　結果:
　　1.3D細胞培養(yǎng)方法的建立
　　經過3D培養(yǎng)的細胞轉入2D培養(yǎng)系統(tǒng)后其增長速率逐漸增快，并顯著高于2D培養(yǎng)的細胞，細胞表型檢測證明3D培養(yǎng)的A549細胞中CD44和CD326陽性比例升高，CD24陽性比例下降。
　　2.肺癌干細胞功能檢測
　　3D培養(yǎng)的細胞體外成球率顯著升高（28.50±1.17％

5、vs8.67±0.80％，P＜0.01），體內成瘤時間顯著縮短（20.75±0.85d vs60.25±1.49d，P＜0.01）。侵襲能力和劃痕修復能力增強（125.67±6.028 vs64.67±11.37，83.75±5.84％ vs35.63±3.05％，P＜0.01），3D培養(yǎng)的干細胞相關基因表達顯著高于2D。
　　3.3D細胞培養(yǎng)在抗癌藥藥效學方面的應用
　　在兩種培養(yǎng)中分別加入不同濃度的順鉑和培美曲塞兩種腫瘤

6、藥物發(fā)現(xiàn)，3D培養(yǎng)的細胞對順鉑耐藥性顯著提高(58.17±2.19％ vs33.27±5.76％ in48h，P＜0.01)，（41.70±5.81％vs27.30±4.25％ in72h，P＜0.01），加藥后β-catenin蛋白的表達遠遠高于2D培養(yǎng)的細胞加藥后的表達。結合MTT檢測得出順鉑和培美曲塞對經過3D培養(yǎng)的A549細胞的半數(shù)抑制濃度IC50分別為6.58±1.25μg/ml和7.86±1.60μg/ml。
　　結論