靶向survivin的siRNA對膀胱癌生物學行為的影響.pdf

1、目的： 1、研究靶向survivin的小分子干擾RNA(siRNA)阻斷膀胱癌細胞凋亡信號通路的效應，并探討survivin基因抗凋亡機制。 2、探討轉染靶向survivin的siRNA對膀胱癌生物學行為的影響及潛在的治療作用。 3、構建靶向survivin的siRNA真核表達載體。 方法： 1、設計、合成一對survivin編碼基因序列特異的小分子干擾RNA(siRNA)，用脂質體包裹轉染T24

2、膀胱癌細胞，分不同的濃度組(50-200 nmol/L)。MTT法檢測細胞生長情況，流式細胞儀測定細胞凋亡率，實時定量PCR檢測survivin基因和caspase3基因mRNA表達。 2、建立膀胱癌T24細胞裸鼠皮下移植瘤模型，隨機分4組，實驗各組分別瘤內注射生理鹽水、5μg tg siRNA、5μg siRNA、5μg MMC，通過測量治療前后腫瘤的體積和病理變化觀察不同劑量siRNA治療效果并與MMC比較并分析處理后裸鼠外

3、周血肝腎功能變化。 3、設計合成靶向survivin的siRNA相應DNA模板單鏈，將其克隆入空質粒pRNAT-U6.1/Neo，模板鏈兩端分別設計兩個不同的酶切位點，退火形成siRNA載體插入片段。用限制性酶切將空載體線性化，T4DNA連接酶將siRNA片段插入空載體中，對該重組表達載體進行鑒定，獲得RNA干擾質粒載體pRNAT-U6.1/Neo-survivin。 結果： 1、survivin編碼基因序列特異

4、性siRNA能有效下調survivin基因表達水平，并呈劑量和時間依賴性，最大效應濃度為100nmol/L，此時與對照相比survivin表達水平下調75.91％，并顯著的抑制了細胞生長，抑制率達55.29％，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時，caspase3 mRNA表達水平明顯上升達239.80％，細胞凋亡率亦增加至45.70％，與對照相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 2、在建立的膀胱癌T24細胞裸鼠皮下移植瘤模

5、型中，采用不同的處理后，腫瘤的生長率各不相同。50μg MMC處理組和50μgsiRNA處理組與對照組相比差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，50μg MMC處理組和50μgsiRNA處理組之間差別無統(tǒng)計學意義(P=0.548)，5μgsiRNA處理組與對照組相比差別無統(tǒng)計學意義(P=0.486)。 3、PCR、酶切鑒定、DNA測序驗證了表達質粒構建成功，無堿基突變。 結論： 1、siRNA-survivin能顯

6、著下調膀胱癌細胞survivin基因表達水平，促進細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，可能成為膀胱癌基因治療的新工具。 2、survivin基因可能是通過下調caspase3表達來抑制凋亡。 3、成功構建了靶向survivin基因表達的RNA干擾質粒載體pRNAT-U6.1/Neo-survivin。 4、通過構建載體導入細胞，在細胞內轉錄產(chǎn)生的siRNA與化學合成的siRNA作用一致，且其轉染率高，作用時間長，費用低，