丹參WRKY轉錄組分析及其在次生代謝物生物合成途徑上的調控研究.pdf

1、丹參(Salvia miltiorrhizaBunge)不僅是一種重要的大宗藥用植物，還是一種研究藥用植物的模式生物。因此，研究丹參次生代謝積累及其轉錄調控機制具有深遠的意義及廣闊的應用前景。WRKY是植物十大轉錄因子家族之一，廣泛參與植物的生長、發(fā)育、生物或非生物脅迫響應等多種生理過程，最近研究發(fā)現(xiàn)該家族成員參與多種次生代謝物合成的調控，然而，有關丹參WRKY轉錄因子(SmWRKY)是否調控次生代謝物的合成卻知之甚少。為此，本文采用生

2、物信息學、分子生物學、植物化學等方法對SmWRKY家族成員的種類、結構特征、表達譜、以及其與次生代謝物積累的關聯(lián)進行了分析。本研究既加深了人們對SmWRKY的認識，又為進一步探索SmWRKY的功能及其調控次生代謝產物合成的機制奠定了基礎。
　　1.從丹參轉錄組庫中共發(fā)現(xiàn)69條完整的SmWRKY的CDS序列，編碼的氨基酸長度范圍：129-706個，等電點(Pi)從4.76-9.9；分子質量(Mw)從15.2-36.2 kDa。SmW

3、RKY的核心結構域不僅有常見的WRKYGQK，還有WRKYGEK、WRKYGKK。根據WRKY核心結構域的數(shù)目及鋅指結構的類型，將WRKY分為3類(I類、II類、III類)，第II類又分為5個亞類(IIa類、IIb類、IIc類、IId類、IIe類)。其中在丹參中發(fā)現(xiàn)13個I類WRKY成員，46個II類WRKY成員，9個III類WRKY成員。為了進一步研究 SmWRKY結構特征，采用在線軟件MEME5.0對SmWRKY氨基酸序列進行保守基

4、序預測，結果表明所有的序列均含保守基序(Motif)Motif1和Motif2，說明此結構是SmWRKY的保守結構域。除此之外，不同類群的WRKY擁有特定的保守序列。這些結果說明SmWRKY家族基因趨異進化，含有較多的功能元件，也暗示該家族基因可能參與多種生理生化調控過程。
　　2.丹參毛狀根培養(yǎng)18d時，添加茉莉酸甲酯(MeJA,100μmol·L-1)，在MeJA處理后第0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、1d、2

5、d、3d、6d、9d采集樣品，采用高效液相色譜(HPLC)對毛狀根中丹酚酸類和丹參酮類部分成分含量進行檢測。同時采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)對SmWRKY、丹參酮類和丹酚酸類生物合成途徑上關鍵酶基因的表達進行檢測。根據基因表達構建heatmap圖結果顯示：大部分WRKY轉錄因子響應MeJA的誘導，表達模式大體分為3類：大部分上調表達，少部分下調表達，一部分在不同時間點上調或下調表達。同時也測定了在MeJA誘導下4種丹參酮類物

6、質(二氫丹參酮I、丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮)和3種酚酸類物質(迷迭香酸、丹酚酸B、咖啡酸)的含量，結果表明在MeJA的誘導下積累量也發(fā)生了顯著的變化。除了丹參酮I外，其它6種次生代謝成分隨時間的增加，積累量不斷增加，從第6d開始，處理組的積累量顯著高于對照組。而丹參酮 I的積累模式處理后第9d，實驗組高于對照組。為了進一步研究SmWRKY與次生代謝物積累之間的關系，我們采用SPSS軟件，雙變量相關性分析―基因-次生代謝物之間的關

7、系，推測SmWRKY36、SmWRKY45等7個WRKY可能參與酚酸類的生物合成；SmWRKY3、SmWRKY12等9個WRKY可能參與丹參酮類生物合成；SmWRKY1、SmWRKY7等7個WRKY可能參與這兩類化合物的生物合成。
　　3.采用qRT-PCR測定不同花期SmWRKY和次生代謝關鍵酶基因的表達，構建heatmap圖。結果顯示：這74個基因表達譜可分為三類，第一類含有7個基因，在莖和葉組織中表達量較高，推測可能參與光合

8、作用等生理活動；第二類包含的基因較多，表達模式多樣化；這可能與WRKY功能多樣化相關。第三類包含兩個基因，SmWRKY47和SmWRKY60，在一些組織中不表達。同時發(fā)現(xiàn)同一類群的WRKY表達模式較為相似，如I、IIb、IIc、IIe和III類WRKY分別有61.％、37.5%、44.5%和66.6%、55.5%的成員在基因表達譜上聚在一起，這可能由于同一類的WRKY序列相似，導致表達模式相似。另外丹參酮合成途徑上有50%的關鍵酶基因，

9、丹酚酸合成途徑上有42.8%的基因表達模式也相似。這可能與這些基因所行使的功能相似所造成。
　　4.從丹參轉錄組庫中獲得完整的SmWRKY65序列，根據序列設計引物克隆該基因，經測序后發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)長度為867bp，共編碼288個氨基酸，含有一個WRKY結構域和一個C2H2鋅指結構域，屬于WRKY基因家族第IIa類成員，與預期結果一致。為了進一步研究其功能，我們克隆了SmWRKY65的編碼區(qū)，構建了SmWRKY65的過表達載體，采用