實驗性牙周炎大鼠模型及miR-23a慢病毒轉染大鼠成骨細胞的建立.pdf

1、在各種頜骨、牙周、根尖周慢性炎癥中,病灶區(qū)都會形成病理性的骨吸收,其中尤以牙周炎癥骨吸收最為嚴重廣泛。牙周病是一種影響牙齒支持組織的感染性疾病,表現出廣泛的臨床、微生物和免疫學臨床特征,并與多層面的特異性感染因子、宿主免疫反應、環(huán)境因素及遺傳易感性等因素的動態(tài)交聯反應相關。牙周治療的理想目標是牙周再生,即“完全的牙周結構與功能性再生”。
　　MicroRNA分子在1993年由Lee等首先發(fā)現存在于線蟲細胞內,繼而被證實廣泛存在于動

2、、植物體內,是真核細胞中一類非編碼調節(jié)性RNA,成熟的microRNAs通過識別并結合靶向互補mRNA3`非翻譯端,遏阻蛋白翻譯和或調節(jié)mRNA的穩(wěn)定性,發(fā)揮廣泛的生物學作用,參與生物體的生長、發(fā)育、免疫防御、衰老、疾病等的過程,被認為是先前生理與疾病研究中所缺失的環(huán)節(jié)。Lee等通過基因芯片技術篩選出了正常與炎癥牙周組織中的差異表達MicroRNAs;Zhou等發(fā)現miR-18a等可促進牙周膜來源干細胞的骨向分化,而miR-23a參與調

3、節(jié)成骨細胞的分化;Liu等人的研究發(fā)現MicroRNAs可持續(xù)調節(jié)炎癥環(huán)境中牙周膜來源干細胞的生物學特性。
　　現在人們對炎癥骨吸收機制的認識并不完全,其中MicroRNAs是否起了作用?如果MicroRNAs在炎癥環(huán)境中調控骨改建,那么又是如何發(fā)揮作用的呢?
　　實驗目的
　　1.觀察大鼠實驗性牙周模型中牙周炎癥環(huán)境中骨吸收的的發(fā)生、發(fā)展及自愈情況,為后期動物體內移植提供實驗基礎。
　　2.建立下調和過表達mi

4、R-23a的大鼠成骨細胞,為后期體內移植做準備。
　　實驗內容
　　1采用結扎上頜右側第一磨牙的方法,誘導大鼠實驗性牙周炎的發(fā)生,32只雄性SD大鼠(第四軍醫(yī)大學動物中心)(200g.±50g)隨機分為4組:結扎7天組;結扎28天組;結扎28天后繼續(xù)喂養(yǎng)7;結扎28天繼續(xù)喂養(yǎng)28天;實驗結束后取頜骨-牙體-牙周聯合樣本,做micro-CT掃描,用于作三維影像重建測量;脫鈣后石蠟包埋切片,用于HE染色、OPG免疫組織化學染色、

5、TRAP染色,觀察牙周炎癥和骨質吸收情況。
　　2.選用新生SD大鼠籽鼠顱骨,II型膠原酶聯合EDTA消化,改良組織塊法培養(yǎng)成骨細胞,取傳代第一代及第二代生長期細胞,經由ALP、茜素紅染色鑒定,MTT測其增殖率;慢病毒構建工作由上海吉凱基因化學技術服務公司完成,將獲得的慢病毒載體轉染成骨細胞,通過共聚焦顯微鏡觀察轉染結果并照相,并計算MOI值。
　　實驗結果
　　1.(1)結扎7天組牙齦組織內炎癥浸潤,牙槽骨表面有破骨

6、細胞生成,牙槽骨高度和根分叉下骨密度值稍下降,但與正常對照相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);(2)結扎21天組炎癥范圍擴大,牙槽骨表面排列有大量破骨細胞,牙槽骨高度和骨密度值下降明顯,與正常對照相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);(3)結扎21天后去結扎7天組炎癥減輕,但仍有大量破骨細胞排列于牙槽骨表面,牙槽骨吸收情況緩解,骨密度值稍上升,但與結扎21天組相比,差異并無統(tǒng)計學差異(P>0.05);(4)結扎21天后去結扎21組

7、牙周組織基本恢復正常,偶見破骨細胞,牙槽骨高度和骨值密度值明顯增加,與結扎21天組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　2.ALP、茜素紅染色鑒定結果顯示所培養(yǎng)細胞具有成骨礦化能力,為成骨細胞樣細胞;共聚焦圖片顯示慢病毒轉染成功,且可持續(xù)表達。
　　結論
　　1.利用結扎法可成功誘發(fā)大鼠牙周炎,去除結扎絲后,牙周炎癥得到控制,牙周組織的再生修復能力啟動,牙周骨質再生。
　　2.成功分離、培養(yǎng)并建立慢病毒轉