低雄激素誘導雄性大鼠血管內皮細胞凋亡的研究.pdf

1、背景：近年來，雄激素與心血管疾病間的關系日益受到重視，在臨床研究工作中，我們發(fā)現部分心血管疾病高發(fā)的中老年男子的雄激素處于低水平狀態(tài)。雄激素不足與心血管疾病的發(fā)生密切相關，而且已有報道，低雄激素水平是血管內皮功能失調的一個獨立危險因素。致病因子可以通過多種途徑損傷血管內皮，其中內皮細胞(EC)的凋亡在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程中起了重要作用。許多促動脈粥樣硬化因子都可以誘導血管內皮細胞凋亡，進一步引起一系病理生理反應，產生相應的心血管

2、疾病。雄激素缺乏作為一種心血管危險因素是否也增加內皮細胞凋亡值得進一步研究。因此本研究通過建立低雄激素大鼠模型，初步探討雄激素缺乏對血管內皮細胞凋亡的影響。本研究分為五個部分：
　　 第一部分：低雄激素大鼠模型的建立。
　　 目的：采用大鼠雙側睪丸切除術，建立低雄激素大鼠模型，并檢測模型是否成功。
　　 方法：18 只雄性SD 大鼠隨機分為三組(n=6)，對照組，給予假去勢；去勢組，施行去勢手術，建成低雄激素模型

3、；替代組，施行去勢手術后，給予肌肉注射睪酮（十一酸睪酮50mg/Kg/月）替代治療；實驗結束時采血測睪酮水平。
　　 結果：而實驗結束時去勢組大鼠血清睪酮水平顯著低于其他兩組（P<0.05）。
　　 結論：采用大鼠雙側睪丸切除術，可以建立低雄激素模型，且具有較好的穩(wěn)定性。
　　 第二部分：去勢大鼠血管內皮及其線粒體病理改變。
　　 目的：觀察大鼠主動脈大體結構及其內皮細胞超微結構。
　　 方法：建

4、模成功10 周末，固定麻醉大鼠，分離腹主動脈，取一段4％多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，部分蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察各組大鼠主動脈結構的病理改變；另取一段2.5％戊二醛固定，透射電鏡觀察血管內皮超微結構改變。
　　 結果：HE 染色結果示，三組大鼠中，對照組主動脈肌層平滑肌細胞排列整齊規(guī)則，內膜光滑完整，薄厚均一，內皮細胞扁平，去勢組主動脈內皮形態(tài)結構排列紊亂，內膜下細胞增生明顯；替代組動脈內膜病變明顯較去勢組減輕。

5、透射電鏡觀察，對照組主動脈內皮細胞扁平，結構清晰，內膜光滑完整，高倍鏡下線粒體形態(tài)、大小均勻，嵴清晰。去勢組主動脈內皮細胞結構不清晰，變性，突起或脫落，染色質凝集，線粒體皺縮，數量減少，嵴溶解。給予雄激素替代治療后其主動脈內皮病變較去勢組明顯減輕。
　　 結論：去勢后大鼠主動脈結構破壞明顯，內皮細胞染色質凝集，線粒體皺縮，數量減少，嵴斷裂，溶解。
　　 第三部分：內皮細胞線粒體膜電位的變化及凋亡情況分析。
　　

6、目的：觀察三組大鼠主動脈內皮細胞線粒體膜電位的變化情況，同時檢測內皮細胞凋亡情況。
　　 方法：采用密度差速離心方法提取內皮細胞線粒體，向提取的線粒體中加入儲存液制備成純化線粒體提取物，將陽離子熒光羰花青染料加入純化線粒體制備物中暗室孵育10min，后用熒光酶標儀檢測，通過熒光信號的強度來分析線粒體內膜功能的完整性；同時取一段主動脈標本，4％多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，采用TUNEL 法檢測血管內皮細胞凋亡情況。
　　

7、 結果：與對照組和替代組相比，去勢組大鼠純化線粒體熒光信號強度明顯減弱，內膜功能受損TUNEL 檢測結果示與其他兩組相比，去勢后大鼠主動脈內皮細胞凋亡數量明顯增多（P<0.05）。
　　 結論：去勢組大鼠血管內皮線粒體膜電位降低，內膜功能受到損害，細胞凋亡增多。
　　 第四部分：線粒體凋亡途徑相關因子在血管內皮表達情況。
　　 目的：觀察三組大鼠主動脈內皮細胞線粒體凋亡途徑中相關因子的表達情況。
　　 方

8、法：采用real time RT-PCR 技術測定內皮細胞bcl-2、caspase-9 和caspase-3 mRNA 表達水平；免疫組化方法檢測內皮細胞細胞色素C(Cytochrome c Cyt C), caspase-9 和caspase-3 蛋白表達情況。
　　 結果：與對照組相比，去勢組內皮細胞bcl-2 表達減少，而Cyt C，caspase-9和caspase-3 表達顯著增高(P<0.05)，替代組與對照組間均

9、無顯著性差異(P>0.05)。
　　 結論：雄性大鼠體內雄激素缺乏時，血管內皮細胞線粒體凋亡抑制因子表達下調，而凋亡相關因子表達上調。
　　 第五部分：內皮細胞體外培養(yǎng)及胞內游離鈣離子濃度測定。
　　 目的：體外培養(yǎng)去勢后大鼠主動脈內皮細胞，觀察細胞內第二信使游離鈣離子濃度改變。
　　 方法：建模成功的大鼠，麻醉固定后，打開腹腔，游離主動脈，采用膠原酶消化法分離純化并培養(yǎng)主動脈內皮細胞，Ⅷ 因子相關抗原鑒