一氧化碳和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白CHOP在環(huán)孢霉素A引起的腎小球內(nèi)皮細胞損傷中的作用.pdf

1、腎移植是腎臟失能的首選治療方法，但移植排異反應將導致移植腎失能，因此需終生使用免疫抑制劑。環(huán)孢霉素A（CyclosporineA,CsA）是重要的抗移植排異反應藥物，但CsA對腎臟具有毒性作用，是移植腎慢性失能的重要原因。腎小球內(nèi)皮細胞(Glomerularendothelialcells,GECs)損傷是移植腎慢性失能的重要機制，但藥理劑量的CsA是否可導致腎小球內(nèi)皮細胞損傷尚不清楚。血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase-1，

2、HO-1)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)起作用的應激蛋白，通過其代謝產(chǎn)物CO等起抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用，可抑制宿主對移植物的排異反應。但HO-1及其作用產(chǎn)物一氧化碳（CO）是否對腎血管內(nèi)皮細胞損傷有保護作用尚未見研究。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（EndoplasmicreticulumstressERs）是亞細胞水平的細胞內(nèi)保護機制，適度的ERs促進細胞修復，重度的ERs誘導無法修復的細胞凋亡，但腎小球血管內(nèi)皮細胞是否存在ERs以及ERs在腎小球血管內(nèi)皮細

3、胞生理與病理生理功能中的作用尚未見報道。
　　目的:利用原代培養(yǎng)的腎小球內(nèi)皮細胞，觀察藥理劑量的CsA對腎小球內(nèi)皮細胞生物學特性和ERs的影響；通過誘導腎小球內(nèi)皮細胞HO-1表達，或給予HO-1產(chǎn)物CO，以探討HO-1與CsA引起的腎小球內(nèi)皮細胞損傷和ERs的關系；利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白CHOP的siRNA抑制CHOP表達，探討ERs在CsA引起的腎小球內(nèi)皮細胞損傷中的作用。
　　方法:貼壁選擇法培養(yǎng)原代大鼠腎小球內(nèi)皮細胞，Cs

4、A刺激復制腎小球內(nèi)皮細胞損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型，用化學誘導劑氯化高鐵血紅素（hemin）促進HO-1表達，外源性一氧化碳分子釋放劑CORM-2處理細胞模擬HO-1的作用，用針對CHOP的siRNA抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激作用，用Westernblot和RT-PCR檢測HO-1、ATF-6和CHOP表達，用annexinV和PI雙染色法、MTT降解法和細胞單層劃痕法分別檢測細胞凋亡、增殖和遷移功能。
　　結果:
　　1．成功原代培養(yǎng)大鼠腎

5、小球血管內(nèi)皮細胞
　　所培養(yǎng)的細胞表達Ⅷ因子相關抗原，細胞單層呈現(xiàn)典型的鵝卵石樣形態(tài)，不傳代培養(yǎng)1-2周后可形成管腔樣結構。
　　2．CsA可損傷腎小球內(nèi)皮細胞和誘導ERs蛋白表達
　　原代培養(yǎng)的腎小球內(nèi)皮細胞給予CsA（25μmol/L）刺激后細胞增殖和遷移功能明顯降低，細胞凋亡顯著增加。CsA刺激8小時后，HO-1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白CHOP的表達增加(P<0.01)，對照組未給予CsA刺激，無CHOP的表達。Cs

6、A對活性和非活性狀態(tài)的CHOP上游ER蛋白ATF-6含量均無顯著影響。
　　3.氯化高鐵血紅素對CsA誘發(fā)的腎小球內(nèi)皮細胞損傷無保護作用
　　HO-1的化學誘導劑氯化高鐵血紅素hemin（20μmol/L）刺激8小時，腎小球內(nèi)皮細胞表達HO-1蛋白和mRNA顯著增加，但其對HO-1表達的促進作用不如藥理劑量（25μmol/L）的CsA明顯。Hemin對細胞增殖、遷移、凋亡和ATF-6表達與活化均無顯著影響，但可抑制CsA誘導

7、的CHOP蛋白表達量(P<0.05)。
　　4.一氧化碳可拮抗CsA對腎小球內(nèi)皮細胞的損傷作用
　　與未經(jīng)任何處理的對照組相比，外源性CO釋放劑CORM-2（30μmol/L，8小時）除了可抑制腎小球內(nèi)皮細胞遷移功能外，對其它指標均無顯著影響。但CORM-2可阻斷CsA引起的細胞增殖抑制和凋亡，降低CHOP表達，對細胞遷移和ATF-6表達與活化無顯著影響。
　　5．CHOP可抑制CsA誘導的腎小球內(nèi)皮細胞凋亡
　

8、　正常腎小球內(nèi)皮細胞不表達CHOP，CsA刺激后CHOP表達和細胞凋亡顯著增加，成功用針對CHOP的siRNA抑制CsA誘導的CHOP表達后，細胞凋亡率降至正常水平，但CHOP-siRNA對CsA的其它生物學作用無顯著影響。
　　結論:本研究發(fā)現(xiàn)藥理劑量的CsA可直接抑制腎小球血管內(nèi)皮細胞生物學功能并誘導其凋亡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白CHOP表達增加是CsA誘導該細胞凋亡的主要機制。HO-1誘導劑hemin對CsA引起的腎小球血管內(nèi)皮細胞