兔骺板軟骨細胞體外培養(yǎng)、鑒定及其細胞表型的研究.pdf

1、背景：骺板損傷占小兒全部長管狀骨骨折的15％-30%，10%的骺板損傷將導(dǎo)致骨骼及關(guān)節(jié)畸形發(fā)育，不但給兒童心理帶來嚴重影響，而且影響肢體功能，甚至喪失勞動能力[1]。組織工程技術(shù)的發(fā)展為治療骺板損傷帶來新的希望，大多數(shù)學(xué)者將重點放在組織工程骺板的構(gòu)建上，并取得初步的成功。因為獲得容易，人們最初將注意力放在軟骨細胞上，但研究發(fā)現(xiàn)軟骨細胞在體外擴增培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)去分化和生物學(xué)功能衰退，并以合成和分泌軟骨基質(zhì)能力下降或消失為標志，因此具有生

2、長潛力的軟骨母細胞一骺板軟骨細胞成為新的研究熱點。
　　目的：體外培養(yǎng)兔骺板軟骨細胞，探索簡便、高效的細胞培養(yǎng)方法。對培養(yǎng)細胞進行初步研究，觀察細胞鏡下形態(tài)、電鏡下細胞超微結(jié)構(gòu)，鑒定細胞是否分泌蛋白聚糖及其含量，鑒定細胞是否能合成II型膠原蛋白及是否表達相應(yīng)mRNA。為骺板組織工程尋找良好的種子細胞，為下一步基因轉(zhuǎn)染結(jié)合支架材料修復(fù)骺板損傷提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法：選取3周齡新西蘭幼兔18只、雌雄不限、健康，體重約250-3

3、00g。分別切取三個部位的軟骨(①股骨遠端及脛骨近端的骺板軟骨;②髂骨;③肋軟骨，經(jīng)改良三步酶消化獲得細胞。將獲得軟骨細胞在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中原代、傳代體外培養(yǎng)。分別取細胞懸液計算細胞產(chǎn)量和細胞成活率并用倒置顯微鏡及透射電鏡觀察培養(yǎng)細胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)，觀察細胞生長狀態(tài)。MTT四唑鹽比色法檢測不同代次骺板軟骨細胞生長活性。Alcian blue染色確定培養(yǎng)細胞有蛋白聚糖生成及定量檢測，免疫組織化學(xué)染色檢測II型膠原蛋

4、白產(chǎn)生， PCR證實細胞有II型膠原蛋白mRNA生成。
　　結(jié)果：本實驗方法體外培養(yǎng)幼兔骺板軟骨細胞，收集過程簡便、高效。培養(yǎng)過程中觀察到股骨遠端及脛骨近端的骺板軟骨細胞在單位重量的細胞產(chǎn)量、生長速度和分化速度上優(yōu)于髂骨、肋軟骨細胞，但在生物學(xué)形態(tài)上，三個部位的細胞無明顯差別。骺板軟骨細胞貼壁生長及傳代的生長全過程，多次傳代后細胞增殖能力逐漸降低，細胞形態(tài)逐漸向“纖維化”細胞轉(zhuǎn)變。前3代細胞具有較高的生物學(xué)及功能學(xué)特性表達。從第4

5、代以后細胞形態(tài)改變逐漸喪失骺板軟骨細胞特有結(jié)構(gòu)，軟骨細胞所特有的II型膠原及蛋白多糖漸消失，出現(xiàn)去分化現(xiàn)象。PCR檢測有II型膠原mRNA的表達、Alcian blue染色顯示第3代細胞蛋白聚糖含量高，MTT顯示第2、3、4代細胞生長曲線呈倒“S”型，第2、3代細胞活性明顯優(yōu)于第4代，培養(yǎng)細胞均于第10天出現(xiàn)生長抑制。
　　結(jié)論：1.兔骺板軟骨細胞通過改良三步酶消化法獲取方便，消化較徹底，存活率高，可獲取大量骺板軟骨細胞。2.體外