喜樹堿對結腸癌細胞系誘導性一氧化氮合酶合成的影響.pdf

1、浙江大學碩士學位論文喜樹堿對結腸癌細胞系誘導性一氧化氮合酶合成的影響姓名：沈香娣申請學位級別：碩士專業(yè)：病理學與病理生理學指導教師：陳增良20060501浙江大學碩士學位論文將生長至對數(shù)生長期的Sw鋁O細胞經(jīng)胰蛋自酶消化后，以約20l釅個，孔接弛于96孔培養(yǎng)板中，放入37℃、5％c02的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時，細胞貼壁后小心棄去舊培養(yǎng)基，每孔加200此含10％新生小牛血清(BCs)、lO肛g，I，的脂多糖(LPs)、20ng，L的自介素

2、lp(IL—ip)的DMEM培養(yǎng)基，加入不同終濃度的喜樹堿溶液分別作用與上述細胞。②測定iNOsInI礬A和蛋白生成量的實驗細胞準備將生長至對數(shù)生長期的sw480細胞消化后以2106，瓶的細胞數(shù)培養(yǎng)，放入37℃、5％C02的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12，J、時，纓胞貼壁后小心棄去f匿培養(yǎng)基，每瓶加lOmL含10％BCS、10州L的LPS、20119／L的ILlp的DMEM培養(yǎng)基，將終濃度為O125p咖nL、O25“咖L的喜樹堿加入上述準備的細胞作

3、用24小時。2喜樹堿對SW480細脆N0生成量的影響(1)取50、100、150、200#moUL的N烈02各100虬，加GrieSS試劑，青4得標準曲線，計算標準方程。(2)按前述準備的細胞分剮培養(yǎng)18小時、24小時，用Griess法測NO的生成量，同時用Mrr法測細胞的存活率。3喜樹堿對S、張80細胞iNOsmRNA表達的影響按1Hzlo試劑盒說明一步法提取Sw480細胞的總RNA，用紫外線分光光度計測定RNA的純度并定量。取總RN

4、A進行逆轉錄，然盾再進行PCR反應，反應產(chǎn)物在15％瓊脂糖凝膠上電泳，應用凝膠掃攢儀對電泳帶進行吸光度掃描，并以GAPDH校正做相對量分析，數(shù)值以兩者積分吸光度的比值表示。4喜樹堿對Sw480細脆iNOS蛋白質表達的影晌將實驗sw480細胞消化離心后加蛋白裂解液提取總蛋白，測定蛋白濃度，上樣，電泳，然后轉移樣品至硝酸纖維素膜上。封閉，加一抗、二抗雜交，用HRP—ECL發(fā)光法檢測，見淡綠色熒光條帶，將膜固定予膠片盒中，曝光后顯影，定影。應