人胚胎干細胞直接誘導分化為功能性肝臟細胞的研究.pdf

1、肝炎、肝硬化、原發(fā)性肝癌、先天性代謝性肝病等難治性、終末期肝病的治療一直都是醫(yī)療界棘手問題。對于各種急、慢性肝功能衰竭，原位肝臟移植是一種較為有效的手段，但是有限的供肝來源卻制約著肝臟移植普遍開展。肝細胞移植有可能成為治療上述疾病的替代或輔助治療方法，但由于肝細胞來源短缺、增殖困難等也限制了肝細胞移植的臨床應用。而近年來隨著干細胞的發(fā)現(xiàn)人們開始探索怎樣利用胚胎干細胞來向肝細胞分化，這樣為臨床細胞替代治療提供合適的細胞來源提供了一個良好的

2、新思路，而且在藥物評估和肝臟發(fā)育分化等基礎研究方面也可發(fā)揮重要的作用。
　　 胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES細胞)是來源于囊胚內細胞團的一種高度未分化細胞，具有無限增殖和發(fā)育全能性等特點，可自發(fā)分化為多種細胞類型，如定向分化為神經細胞、心肌細胞、造血細胞、平滑肌細胞、軟骨細胞等。在非肝源性干細胞研究領域，自2001年Hamazaki等[1]首次報道誘導ES細胞分化為肝臟細胞以來，ES源性肝臟細胞的體外研

3、究迅速開展起來，但至今仍沒有建立一個高效安全的誘導胚胎干細胞向肝細胞分化的培養(yǎng)體系。
　　 本課題擬運用體外直接誘導方法，探討表觀遺傳修飾聯(lián)合多種細胞因子誘導人胚胎干細胞分化為功能性肝臟細胞可行性，試圖建立起有效的誘導胚胎干細胞向肝細胞分化的誘導培養(yǎng)體系。
　　 人胚胎干細胞直接誘導分化為功能性肝臟細胞
　　 目的:
　　 運用直接誘導的方法，探討表觀遺傳修飾聯(lián)合多種細胞因子體外誘導人胚胎干細胞分化為功能

4、性肝臟樣細胞的可行性，試圖建立有效的誘導胚胎干細胞向肝細胞分化的培養(yǎng)體系。
　　 方法:
　　 用RT-PCR檢測pou5f1基因的表達鑒定H9人胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES細胞)的未分化特性，然后常規(guī)培養(yǎng)增殖ES細胞。誘導開始：傳代ES細胞消化成細胞團塊懸液后以1×104的密度種入鋪有基質膠的6孔板中，加誘導培養(yǎng)液誘導培養(yǎng)(見表一)，整個誘導過程持續(xù)十七天。分化過程中用光學顯微鏡觀察各組細胞

5、密度及形態(tài)學改變；RT-PCR檢測誘導的肝樣細胞特異性基因白蛋白(albumin，ALB)、甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)、α1抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,AAT)、甲狀腺素運載蛋白(transthyretin，TTR)、酪氨酸轉氨酶(tyrosine aminotransferase，TAT)、肝細胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor4α，HNF4α)、肝細胞核因子3β(hep

6、atocyte nuclear factor3β，HNF3β)、膽固醇7α-羥化酶A1(Cholesterol7α-hydroxylaseA1，CYP7A1)、細胞角蛋白18(cytokeratin18，CK18)、細胞角蛋白19(cytokeratin19，CK19)，的mRNA表達；免疫熒光化學檢測肝細胞特異性的蛋白AFP、ALB、CYP7A1、FVⅢ、FIX的表達。最后通過糖原染色試驗和吲哚氰綠攝取試驗來檢測經誘導分化的細胞是否具

7、有肝臟細胞特異性的功能。表一：細胞誘導流程圖(所加誘導因子及誘導時間)(圖表略：)注所用的試劑濃度分別為：Activin A(激活素A)100ng/ml、 SB(丁酸鈉)2.5mmol/L、BMP-4(骨形成蛋白4)10ng/ml、HGF(肝細胞生長因子)10ng/ml、OSM(致瘤素M)10ng/ml、Dex(地塞米松)10-7M、DMSO(二甲基亞砜)0.5％
　　 結果:
　　 1.細胞誘導結果：
　　 1

8、.1光鏡結果：
　　 1.1.1細胞密度：
　　 以1×104的密度種入鋪有基質膠的6孔板中，以小鼠成纖維細胞條件培養(yǎng)液(CM)及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)來培養(yǎng)hESC，第二天觀察發(fā)現(xiàn)細胞開始以小克隆的形式貼壁，到第四天克隆慢慢增殖達70％-80％富集時，培養(yǎng)液換為誘導培養(yǎng)液。誘導第一天到三天，培養(yǎng)板中出現(xiàn)大量漂浮的死細胞。第四到九天，存活下來的形態(tài)成卵圓形的細胞開始向四周蔓延和增殖。第十到十一天，細胞繼續(xù)增殖

9、且形態(tài)趨于均一。誘導最后六天，細胞有少量死亡和老化的現(xiàn)象。經過十七天誘導后，培養(yǎng)板中細胞主要以鋪路石樣形態(tài)的肝臟細胞鋪于整個培養(yǎng)板的孔中。
　　 1.1.2細胞形態(tài)：
　　 以CM加bFGF培養(yǎng)四天以后，誘導開始，撤除bFGF，加上誘導液。實驗初期，實驗組的變化主要是死細胞增多，原克隆變薄，立體感變弱，細胞形態(tài)無多大變化。誘導中期，克隆繼續(xù)變薄并向周邊分化，分化的細胞逐漸由圓形或類圓形轉變成多角形。到誘導末期實驗組可見有

10、鋪路石狀排列緊密的肝細胞樣細胞，但細胞也有空泡樣變，折光率下降等。
　　 1.2 RT-PCR結果：
　　 經過17天的誘導，誘導的細胞能夠不同程度地表達標志肝臟細胞發(fā)育過程的ALB、AFP、TTR、AAT、TAT、HNF-3β、HNF-4α、CYP7A1、CK18、CK19的mRNA。(附圖)
　　 1.3免疫熒光化學檢測結果：
　　 誘導分化的細胞中有部分細胞ALB、AFP、CYP7A1、FVⅢ、FI