小鼠αA晶體蛋白啟動子報告基因載體的構建以及啟動子活性的檢測.pdf

1、目的：克隆小鼠αA-Crystallin基因特異性啟動子活性片段，并構建以小鼠αA-Crystallin基因啟動子（αACP）驅動的增強型綠色熒光蛋白（EGFP）雙順反子特異表達載體，為白內障基因治療藥物的開發(fā)提供前期實驗基礎。
　　 方法：利用PCR技術，從小鼠總DNA上擴增αA-Crystallin基因特異性啟動子活性片段，應用TA克隆技術構建pMD19-T-αACP，克隆小鼠αA-Crystallin基因特異性啟動子活性片

2、段，并通過測序證實其克隆成功。利用基因重組技術將小鼠αA-Crystallin基因特異性啟動子活性片段（αACP）替換真核表達載體pIRES2-EGFP上的CMV啟動子，命名融合質粒為pαACP-IRES2-EGFP，將其注射入大鼠幼鼠的晶狀體球后，在熒光顯微鏡下觀察晶狀體冰凍切片，通過增強型綠色熒光蛋白的表達效果來驗證啟動子的活性。
　　 結果：通過pMD19-T-αACP融合質粒的測序證實小鼠αA-Crystallin基因特

3、異性啟動子活性片段（αACP）克隆成功，并構建于pIRES2-EGFP質粒中形成融合質粒pαACP-IRES2-EGFP，對其融合質粒上αACP基因片段行PCR擴增、酶切圖譜分析獲得412bp的αACP目的條帶，經測序鑒定與基因庫中（NC00083）小鼠αACP序列相比有99％的同源性，表明成功構建了包含小鼠αA-Crystallin啟動子活性片段（αACP）的特異表達載體pαACP-IRES2-EGFP，將其注射入大鼠幼鼠的晶狀體球后