1、研究背景:
心肌梗死是世界范圍內(nèi)致死致殘的主要原因之一。全世界約三分之一的心衰患者是由它導(dǎo)致的，盡管現(xiàn)在已經(jīng)有了很多治療措施。實際上，一支主要的冠狀動脈的堵塞可以致使心肌的嚴重缺血和心肌細胞的快速凋亡，進而導(dǎo)致進行性的纖維化代替心肌組織和左心室的擴張。進展性的左心室重構(gòu)可以導(dǎo)致心肌梗死后心衰，而心衰患者的預(yù)后目前情況依然不容樂觀。因此，目前以促進新生血管來增加缺血組織灌注的方法，成為治療缺血性心臟疾病的新的希望。
通
2、心絡(luò)是一種中國傳統(tǒng)的中藥復(fù)方制劑，早在1996年被中國國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準用于心絞痛和缺血性腦卒中的治療。越來越多的證據(jù)表明，傳統(tǒng)中藥通心絡(luò)具有心臟保護作用。通心絡(luò)對于降低血清脂質(zhì)含量、抑制斑塊炎癥和增強易損斑塊的穩(wěn)定性方面，具有良好的療效。它還可以用來治療心肌缺血無復(fù)流和缺血再灌注損傷，并可以改善血管內(nèi)皮功能，然而，我們并不清楚通心絡(luò)在心肌梗死后對心臟功能和心臟重構(gòu)方面是否有作用。因此，我們設(shè)計了這個實驗來研究通心絡(luò)對心肌梗死
3、后小鼠的心臟功能和心臟重構(gòu)情況的影響，及其作用機制。
研究目的:
1.建立小鼠心肌梗死模型，觀察通心絡(luò)對心肌梗死導(dǎo)致缺血后心臟功能和心室重構(gòu)的影響。
2.闡明通心絡(luò)對心肌梗死保護效果的可能的作用機制。
研究方法:
1.動物分組
C57BL/6背景小鼠（10周齡，雄性），隨機分為5組。(1)假手術(shù)組;(2)心肌梗死模型組，只用生理鹽水溶液灌胃(10mL/kg/day);(3)通心
4、絡(luò)低劑量治療組，通心絡(luò)灌胃量為0.38克/千克體重/天;(4)通心絡(luò)中劑量治療組，通心絡(luò)灌胃量為0.75克/千克體重/天;(5)通心絡(luò)高劑量治療組，通心絡(luò)灌胃量為1.5克/千克體重/天。術(shù)前預(yù)喂藥1周，術(shù)后持續(xù)灌胃30天，分別在術(shù)后第7天處死各組實驗小鼠10只～15只，30天末處死剩余全部小鼠。
2.小鼠心肌梗死模型的建立
使用異氟烷麻醉小鼠并給予維持，建立呼吸支持，模型組與治療組均行冠狀動脈左前降支結(jié)扎術(shù)。頸部及左
5、前胸脫毛，剪開頸部皮膚，行氣管插管。建立有效呼吸支持后，開胸，剪開心包，暴露冠狀動脈左前降支。用7-0的無損縫合線進行冠狀動脈結(jié)扎，結(jié)扎成功后，左心室前壁會變蒼白并且運動異常，逐層關(guān)胸。假手術(shù)組只開胸穿線，不結(jié)扎冠狀動脈，手術(shù)時間與其他組匹配。
3.超聲分析
術(shù)后30天時，將異氟烷麻醉的小鼠進行經(jīng)胸超聲心動圖檢測，用來評估左心室功能。選取頻率為35MHz的712型超聲探頭進行的心臟大小和功能參數(shù)的采集，用高分辨率超聲
6、Vevo770系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析。探頭放置于小鼠左前胸，在心臟乳頭肌水平進行M型超聲檢測，測量舒張末期左心室內(nèi)徑(LVIDd)、收縮末期左室內(nèi)徑(LVIDs)。系統(tǒng)自動算出射血分數(shù)、短軸縮短率。
4.組織學(xué)分析
術(shù)后7天、30天，處死相應(yīng)小鼠，使用小鼠左心室石蠟切片進行組織學(xué)分析。在相應(yīng)時間點麻醉后，開胸，剪開右心耳，進行生理鹽水灌注，注射少量10％氯化鉀使之停搏在舒張期，待血液沖洗干凈，進行甲醛灌注固定、組織脫水、浸
7、蠟切片。制備51μm石蠟于HE染色、Masson三色染色及免疫組化（熒光）染色。使用HE染色切片計算左心室梗死百分比;使用Masson染色進行測量梗死周邊區(qū)間質(zhì)纖維化;使用免疫組化檢測相關(guān)指標的陽性率。分析使用IPP圖像處理軟件。
5.凋亡檢測
使用原位細胞凋亡檢測試劑盒檢測梗死周邊區(qū)心肌細胞的凋亡率，整個核完全被染色的心肌細胞被認為是凋亡細胞。
6.毛細血管密度
使用CD31(PECAM-1)作
8、為血管內(nèi)皮標志物，檢測圍梗死區(qū)毛細血管密度。
7.蛋白表達水平檢測(Western Blot)
術(shù)后7天，提取梗死心臟周邊區(qū)的組織進行蛋白表達水平的檢測。提取蛋白、測定蛋白濃度、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育一抗及二抗最后用化學(xué)發(fā)光顯色。用IPP軟件進行表達量分析。
8.凝膠電泳遷移分析(EMSA)
使用凝膠電泳遷移分析(EMSA)化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒檢測缺氧誘導(dǎo)因子1α活性。提取圍梗死區(qū)心臟組織核蛋白，電泳
9、，交聯(lián)，封閉，化學(xué)發(fā)光檢測。
9.數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤表示。用SPSS18.0軟件做統(tǒng)計分析。組間比較使用單因素方差分析(one-wayANOVA)分析方法，檢驗方差齊性，若數(shù)據(jù)方差齊，使用LSD檢驗;若數(shù)據(jù)方差不齊，使用Dunnett's T3檢驗。P＜0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)意義。
研究結(jié)果:
1.一般情況及生存率分析
假手術(shù)組小鼠術(shù)后無死亡，一般情況良好。通心絡(luò)干預(yù)減少了實驗
10、性心肌梗死小鼠的死亡率。
2.心臟超聲檢測
術(shù)后30天檢測左心室功能參數(shù)，通心絡(luò)治療改善了心肌梗死后心臟功能參數(shù)。
3.梗死大小
H&E染色顯示，應(yīng)用通心絡(luò)治療后，梗死百分比顯著減小。
4.心肌間質(zhì)纖維化
使用Masson染色檢測梗死周邊區(qū)的纖維化程度。應(yīng)用通心絡(luò)后，可以顯著減少心梗引起的纖維化情況。
5.TUNEL染色
經(jīng)過通心絡(luò)干預(yù)后，心肌梗死引發(fā)的凋亡
11、情況顯著改善。
6.毛細血管密度
與模型組相比較，通心絡(luò)各組表現(xiàn)出更高的毛細血管密度。
7.Western blot
通心絡(luò)治療可以增加PI3K、磷酸化AKT、磷酸化ERK、磷酸化eNOS和血管生長因子的表達。
8.EMSA
通心絡(luò)治療增加了缺氧誘導(dǎo)因子1α的DNA結(jié)合活性。
結(jié)論:
1.通心絡(luò)具有改善心肌梗死小鼠后心臟功能和減弱心室重構(gòu)的作用。
評論
0/150
提交評論