香菇多糖增強(qiáng)吉西他濱抑制膀胱癌的療效分析及其影響荷瘤小鼠化療前后免疫應(yīng)答功能的作用研究.pdf

1、目的:
　　膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)，膀胱癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第十一位，其形成過(guò)程復(fù)雜，多種基因參與其中，可分為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(NMIBC)、肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(MIBC)和轉(zhuǎn)移性膀胱癌，其中20～30％的新發(fā)病例是MIBC[1]。MIBC的治療以根治性膀胱切除及盆腔淋巴結(jié)清掃為主，術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)30～45％，5年生存率為45～66％[2]。微轉(zhuǎn)移灶是局部治療MIBC失敗的主要原因之一;約50％新診斷的M

2、IBC患者已發(fā)生潛在的局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，MIBC僅手術(shù)治療效果有時(shí)并不理想，以及部分患者不能通過(guò)手術(shù)完全切除病灶，臨床往往會(huì)輔以放、化療為主的治療手段。輔助化療可以使病理分期明確、有轉(zhuǎn)移證據(jù)的患者受益于系統(tǒng)化療，減少局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的可能性。因此，輔助化療更早地被醫(yī)生和患者接受，因?yàn)榧膊∠嚓P(guān)病死率越高的患者從輔助化療受益的程度也就越高。吉西他濱(Gemcitabine，GEM)是一種脫氧胞苷類(lèi)似物.屬嘧啶類(lèi)，是細(xì)胞周期特異性抗腫瘤代

3、謝類(lèi)藥物，主要作用于S期細(xì)胞，抑制DNA合成，并可阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。GEM在全身多系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)揮了巨大的作用，已成為非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌術(shù)后化療的一線(xiàn)用藥[3]。臨床治療中GEM常與其他藥物聯(lián)用，發(fā)展出一系列的聯(lián)合治療方案都收到了較好的效果。值得關(guān)注的是，化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，難免會(huì)使正常細(xì)胞收到一定的損害，產(chǎn)生相應(yīng)的毒副反應(yīng)，如骨髓抑制，免疫功能下降等等。化療藥物帶來(lái)的各種不良反應(yīng)也影響了化療的持

4、續(xù)實(shí)施，同時(shí)患者的年齡、腎功能和經(jīng)濟(jì)狀況也是影響接受化療的原因。因此，在尋求殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，又可以增加或者重建免疫功能，成為了臨床研究的新方向。
　　現(xiàn)代研究證實(shí)，惡性腫瘤的患者往往存在不同程度的免疫功能缺陷[4,5]。理論上，人體強(qiáng)大的免疫系統(tǒng)通過(guò)細(xì)胞免疫機(jī)制產(chǎn)生排斥反應(yīng)，使突變細(xì)胞在未形成腫瘤之前即被清除，實(shí)際上許多腫瘤仍可逃避宿主的免疫攻擊而繼續(xù)生長(zhǎng)，主要原因是由于患者全身免疫和腫瘤部免疫微環(huán)境的變化，造成腫瘤的免疫逃逸。

5、腫瘤與免疫系統(tǒng)之間存在復(fù)雜的相互作用[6]，表現(xiàn)在:①免疫系統(tǒng)通過(guò)免疫應(yīng)答抑制腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展;②免疫系統(tǒng)通過(guò)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)反而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、存活和血管形成;③腫瘤利用免疫調(diào)節(jié)機(jī)制形成免疫抑制微環(huán)境，不僅抑制宿主免疫應(yīng)答，而且形成了一道阻斷抗腫瘤性免疫治療的屏障。機(jī)體的抗腫瘤免疫效應(yīng)機(jī)制包括細(xì)胞免疫和體液免疫兩個(gè)方面[7]，T細(xì)胞主導(dǎo)細(xì)胞免疫功能，是機(jī)體免疫對(duì)抗腫瘤的主力，NK細(xì)胞則具有非特異性抗腫瘤作用，二者在腫瘤細(xì)胞免疫中的地位越來(lái)越

6、受到人們的重視;B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫在抗腫瘤免疫中起協(xié)同作用。有證據(jù)顯示腫瘤可以導(dǎo)致外周T細(xì)胞功能?chē)?yán)重受損，降低循環(huán)T細(xì)胞的反應(yīng)性從而導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制[8]。在膀胱癌動(dòng)物模型中，外周血中T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，尤其是在腫瘤組織T淋巴細(xì)胞數(shù)目減少更加明顯，也是惡性腫瘤免疫逃逸的主要機(jī)制之一[9]。所以研究膀胱癌免疫功能抑制機(jī)制，在應(yīng)用化療藥物有效治療的同時(shí)，找到其免疫功能恢復(fù)的方法，對(duì)膀胱癌的預(yù)防和治療有重要理論及臨床意義。香菇多糖(Lent

7、inan)是從優(yōu)質(zhì)香菇子實(shí)體中提取的有效活性成分，具有抗腫瘤的作用，進(jìn)入人體后誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生一種具有免疫活性的細(xì)胞因子，增強(qiáng)體內(nèi)自然殺傷細(xì)胞的活性，對(duì)腫瘤細(xì)胞起到防御和殺傷的作用[1]。
　　目前，香菇多糖主要作為一種免疫輔助藥物應(yīng)用于臨床，能配合其他抗腫瘤藥物有效促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖，并激發(fā)自然殺傷細(xì)胞活性，部分研究發(fā)現(xiàn)其本身對(duì)實(shí)體瘤也有一定的抑制作用[11]，目前針對(duì)其抑制膀胱癌的作用鮮有研究，尤其是與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用抑制膀

8、胱癌的研究尚無(wú)報(bào)道。本研究分別或聯(lián)合應(yīng)用化療藥物（吉西他濱）和免疫調(diào)節(jié)劑（香菇多糖）作用于膀胱癌細(xì)胞系T24，觀(guān)察不同給藥時(shí)序所產(chǎn)生的不同作用效果，進(jìn)一步明確香菇多糖在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)T24細(xì)胞增殖和凋亡的影響作用，同時(shí)明確應(yīng)用香菇多糖對(duì)吉西他濱抑癌效果起到增效、增敏的作用。另外，通過(guò)建立MB49鼠膀胱癌細(xì)胞C57BL/6小鼠模型，檢測(cè)免疫相關(guān)細(xì)胞因子的分泌及T淋巴細(xì)胞分布時(shí)相改變從而探討膀胱癌腫瘤免疫抑制發(fā)生的具體機(jī)制;檢測(cè)膀胱癌小鼠經(jīng)化

9、療治療前后免疫功能變化情況，以及應(yīng)用香菇多糖對(duì)免疫應(yīng)答功能的改善情況。通過(guò)本課題的研究可了解香菇多糖增強(qiáng)吉西他濱抑制膀胱癌的作用;膀胱癌免疫抑制的分子機(jī)制，應(yīng)用吉西他濱對(duì)免疫功能的影響以及應(yīng)用香菇多糖對(duì)接受化療的荷瘤小鼠免疫功能的影響及其作用機(jī)制，為膀胱癌的預(yù)防及治療提供理論基礎(chǔ)和新的思路。
　　材料和方法:
　　體外培養(yǎng)人膀胱癌細(xì)胞系T-24，采用MTT法檢測(cè)不同濃度和作用時(shí)間的吉西他濱、香菇多糖單獨(dú)對(duì)細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)，

10、繪制濃度-生長(zhǎng)抑制率曲線(xiàn)，計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50; MTT法檢測(cè)吉西他濱聯(lián)合香菇多糖不同給藥時(shí)序?qū)-24細(xì)胞的增殖抑制作用;Annexin-V-FITC/PI雙標(biāo)記染色法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組對(duì)細(xì)胞凋亡的影響及PI單染法檢測(cè)各組對(duì)細(xì)胞周期的影響;Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Survivin的表達(dá)變化。構(gòu)建Mb49鼠膀胱癌細(xì)胞C57BL/6小鼠皮下成瘤模型，分別應(yīng)用單藥或聯(lián)合用藥模式，記錄治療后各組小鼠成瘤情況，繪制生

11、長(zhǎng)曲線(xiàn)、解剖小鼠、測(cè)量瘤重、取出脾臟及淋巴結(jié)，并通過(guò)細(xì)胞流式染色檢測(cè)不同組別小鼠脾臟及脾周淋巴結(jié)CD3+ CD8+T細(xì)胞、CD3+ CD4+T細(xì)胞數(shù)量百分比;進(jìn)一步檢測(cè)抗原提呈細(xì)胞包括CD11B+ F4/80巨噬細(xì)胞、CD11b+ Gr-1單核髓系抑制細(xì)胞(MDSCs)、樹(shù)突狀細(xì)胞兩個(gè)亞群CD11c+TRL4+ DC及CD11c+TRL9+ DC數(shù)量;以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg) CD4+ CD25+ Foxp3+、CD152+T細(xì)胞數(shù)

12、量變化，動(dòng)態(tài)觀(guān)察C57BL/6小鼠Th1免疫應(yīng)答的差異;通過(guò)ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清IFN-γ、 IL-2、IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子差異，進(jìn)一步驗(yàn)證香菇多糖協(xié)同吉西他濱抑制膀胱癌的作用，應(yīng)用吉西他濱化療對(duì)免疫功能的影響，以及應(yīng)用香菇多糖后免疫功能的變化和其可能的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用-x±s表示，實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，兩變量相關(guān)分析

13、采用Pearson相關(guān)分析，P＜0.05差異具有顯著意義，P＜0.01差異具有極顯著意義。
　　結(jié)果:
　　吉西他濱單獨(dú)用藥組對(duì)T-24細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性;香菇多糖單獨(dú)用藥組在其濃度＜80ug/ml時(shí)對(duì)T-24細(xì)胞的增殖抑制作用亦呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴(lài)性，但當(dāng)香菇多糖濃度達(dá)到80ug/ml時(shí)，T-24細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，增加香菇多糖的藥物濃度但抑制率無(wú)明顯改變(P＞0.05)。MTT結(jié)果提示兩藥聯(lián)合時(shí)對(duì)

14、T-24細(xì)胞的抑制作用明顯強(qiáng)于單一用藥，結(jié)果差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);且最佳給藥時(shí)序?yàn)閮烧咄瑫r(shí)給藥。Annexin-V-FITC/PI雙標(biāo)記染色法結(jié)果也提示兩藥同時(shí)處理T-24細(xì)胞時(shí)的凋亡率高于其他處理組(P＜0.01)。PI單染法結(jié)果示吉西他濱和香菇多糖單獨(dú)用藥組或兩者聯(lián)合用藥組都能使S期細(xì)胞比例減少，G1期比例增加(p＜0.05)，其中吉西他濱單藥或香菇多糖單獨(dú)用藥作用下停滯于G1期的細(xì)胞更多些，處于S期細(xì)胞更少些(

15、p＜0.05)，但兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。Mb49鼠膀胱癌細(xì)胞移植可成功建立C57BL/6小鼠植瘤模型。給予香菇多糖輔助治療后小鼠生存期較單用吉西他濱延長(zhǎng)，腫瘤體積和腫瘤重量減小，給予香菇多糖可以大大提高抗腫瘤免疫應(yīng)答增加CD3+ CD4+T細(xì)胞和CD3+ CD8+T細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)IFNγ和IL-2分泌，增加CD11c+ TRL4+ DCs的百分比，還可促進(jìn)CD11b+F4/80+巨噬細(xì)胞活化;香菇多糖的使用還可明顯降

16、低MDSCs數(shù)量，也可降低CD4+ CD25+ Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量，抑制IL-10分泌，組間差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，香菇多糖單獨(dú)用藥可以抑制膀胱癌細(xì)胞系T24增殖及誘導(dǎo)凋亡，吉西他濱與香菇多糖聯(lián)合作用于人膀胱癌T-24細(xì)胞時(shí)，香菇多糖對(duì)吉西他濱起到增效、增敏的作用，對(duì)T-24的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用明顯大于單一用藥，且最佳時(shí)機(jī)可能是兩種藥物同時(shí)作用于T-24細(xì)胞。

17、
　　應(yīng)用香菇多糖后荷瘤小鼠生存期較單用吉西他濱延長(zhǎng)，腫瘤體積和腫瘤重量減小，且可以大大提高抗腫瘤免疫應(yīng)答，增加CD3+ CD4+T細(xì)胞和CD3+ CD8+T細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)IFNγ和IL-2分泌，間接達(dá)到抗腫瘤的作用;而這這一作用可能是通過(guò)DCs活化，尤其是CD11c+ TRL4+ DCs的活化誘導(dǎo)有效的Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答而達(dá)到的，TLR4是介導(dǎo)MB49荷瘤小鼠DCs活化的重要模式識(shí)別受體;另外香菇多糖還可促進(jìn)CD11b+F4/8