ADAMTS-7和ADAMTS-12抑制軟骨分化的功能研究.pdf

1、金屬蛋白酶ADAMTS-7和ADAMTS-12同屬于ADAMTS家族（含TSP結構的去整合素金屬蛋白酶，a disintegrin and metalloprotease with thromospondin motifs，ADAMTS），其對降解軟骨細胞外基質蛋白和關節(jié)炎具有非常重要的作用。ADAMTS家族含有分泌性鋅指蛋白，并且有較嚴謹的分子結構，至少包括一個thrombospondin motif重復結構。這個家族具有重要的功能，

2、ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、ADAMTS-8、ADAMTS-9、ADAMTS-16和ADAMTS-18可以降解多聚蛋白糖，ADAMTS-5在小鼠關節(jié)炎模型中蛋白多聚糖的丟失上起著重要的作用。ADAMTS-7和ADAMTS-12具有相同的結構域組成，構成ADAMTS家族的亞型。我們最初報道ADAMTS-7和ADAMTS-12直接結合并降解軟骨寡聚基質蛋白（cartilage oligomeric matrix p

3、rotein，COMP），一種軟骨最主要的非膠原組成物。另外，我們研究發(fā)現α-2-巨球蛋白可以抑制COMP蛋白的降解。最近還有研究發(fā)現ADAMTS-12也能夠降解軟骨聚集蛋白多糖。 本文的研究發(fā)現，在軟骨分化過程中ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達量都顯著增高，意味著在骨骼發(fā)育中ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達量在時間、空間上都有變化。我們的研究重點關注．ADAMTS-7和ADAMTS-12在軟骨分化中的作用，

4、以及涉及到的分子機制。我們研究發(fā)現ADAMTS-7和ADAMTS-12蛋白在軟骨分化中被誘導表達。實時熒光定量PCR結果揭示在體外軟骨分化的第5天，這兩種蛋白的表達量還較低，但從第7天開始，他們的量成三倍增長，并在分化后期一直維持此高表達狀態(tài)。本文中，我們首次發(fā)現ADAMTS-7和ADAMTS-12都能夠抑制軟骨細胞的分化及軟骨成骨。 我們研究發(fā)現ADAMTS-7對軟骨細胞的分化及軟骨成骨的抑制功能是依賴于ADAMTS-7的蛋白

5、酶活性的。ADAMTS-7的cysteine-rich結構域對于ADAMTS-7與細胞外基質相互作用和細胞膜表面定位是必不可少的，C-末端的4個thromospondin motif結構域對于ADAMTS-7的蛋白水解酶活性和抑制軟骨細胞分化功能也是必需的。因此，ADAMTS-7對于軟骨細胞分化和軟骨成骨，是一個潛在的負調控因子，這種抑制功能嚴格地依賴于ADAMTS-7的酶切活性。而當ADAMTS-7發(fā)生點突變后，則完全喪失了酶切活性，

6、同時也喪失了對軟骨細胞的抑制作用。ADAMTS-7由多個功能性亞基構成，包括一個鋅離子催化結構域和其他幾個非催化結構域，包括：1個disintegrin結構域、1個thrombospondin結構域、1個cysteine-rich結構域（CRD）、1個spacer-1結構域、3個thrombospondin motifs、1個spacer-2結構域和C-末端4個thrombospondin motifs。研究發(fā)現C-末端的4個throm

7、bospondin motifs具有結合底物的功能，如結合COMP，而ADAMTS-7的其他功能結構域的生物學功能卻還都不清楚。為了揭示各個結構域的功能，我們構建了一系列的ADAMTS-7的C-末端缺失突變體，發(fā)現ADAMTS-7的cysteine-rich結構域對于ADAMTS-7與軟骨細胞外基質相互作用和細胞膜表面定位是必不可少的。然而有趣的是，ADAMTS-7及一系列C-末端缺失突變體蛋白在Cos-7細胞中的檢測結果顯示，cyst

8、eine-rich結構域對ADAMTS-7蛋白定位的影響，是有細胞類型特異性的。另外，ADAMTS-7的酶切活性同樣也受到非催化亞基的調控，尤其是C-末端的4個thrombospondin motifs和抑制性spacer-2結構域。 ADAMTS-7和ADAMTS-12是PTHrP重要的靶分子，原因如下：（1）PTHrP誘導ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達，（2）在PTHrP基因敲除小鼠的軟骨生長板上幾乎檢測不到A

9、DAMTS-7和ADAMTS-12的表達，（3）沉默ADAMTS-7/ADAMTS-12或用特異性抗體封閉ADAMTS-7/ADAMTS-12的活性，則幾乎阻斷了PTHrP介導的抑制軟骨細胞肥大化和軟骨成骨的生長。研究發(fā)現ADAMTS-7和一個新的軟骨生長因子GEP（Granulin-epithelin precursor）相互作用。骨骺生長板內的軟骨內骨化過程，涉及多個信號傳導途徑。我們的研究證明：1）過表達ADAMTS-7和ADAM

10、TS-12誘導PTHrP，抑制IHH：2）在體外軟骨分化過程中，PTHrP促進ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達；3）在小鼠生長板軟骨細胞中，ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達依賴于PTHrP信號途徑。這些研究結果揭示在軟骨分化過程中，ADAMTS-7、ADAMTS-12和PTHrP信號途徑之間存在一個正反饋通路。另外，ADAMTS-7、ADAMTS-12是PTHrP的下游靶分子，基于以下原因：1）PTHrP抑制軟骨分化

11、過程中Col X的表達，然而當通過特異性干擾RNA抑制．ADAMTS-7/ADAMTS-12或用抗ADAMTS-7/ADAMTS-12的抗體封閉后，PTHrP的抑制作用則消失了；再次表達ADAMTS-7/ADAMTS-12，則PTHrP的抑制作用又重新回復；2）ADAMTS-7/ADAMTS-12抗體的封閉，則完全中和了PTHrP所抑制的軟骨細胞肥大化、礦化和骨生長。另外，研究發(fā)現PTHrP促進軟骨細胞的增殖，ADAMTS-7發(fā)現也具有

12、促進軟骨細胞增殖的功能，而且此促細胞增殖作用主要依賴于C-末端的4個thrombospondin motifs結構域。 另外ADAMTS-7可以作為GEP-轉化酶，抵消GEP刺激誘導的軟骨分化及軟骨內成骨。總之，我們的試驗結果證明，ADAMTS-7是PTHrP信號途徑下游的非常重要的靶分子，負調控軟骨內成骨過程；直接結合、轉化GEP，從而失活軟骨分化生長因子GEP的誘導分化作用。GEP是一種生長因子，參與組織重生、腫瘤形成和炎癥

13、過程。研究發(fā)現GEP與彈性蛋白酶結合，被彈性蛋白酶降解。彈性蛋白酶消化GEP的顆粒內連接子，產生微粒多肽；然而分泌性白細胞蛋白酶抑制因子（secretory leukocyte protease inhibitor，SLPI）直接結合到彈性蛋白酶或抑制顆粒多肽與蛋白酶的結合，繼而封閉彈性蛋白酶的活性。最近研究揭示蛋白酶3也結合并降解GEP；蛋白酶3和彈性蛋白酶都通過降解抗炎癥作用的GEP，從而達到促進嗜中性粒細胞依賴性的致炎癥功能。本文

14、中，我們提供了足夠的試驗證據表明GEP和金屬蛋白酶ADAMTS-7在軟骨細胞內相互作用，ADAMTS-7可以將GEP轉化為小分子片段；另外，GEP能具有促進軟骨細胞分化和軟骨成骨，而ADAMTS-7很可能是通過失活GEP的活性而抑制軟骨分化及軟骨成骨的。我們以往研究發(fā)現：1）ADAMTS-7結合并降解COMP，2）COMP和GEP相互作用，促進GEP刺激的軟骨分化功能。結合現在我們的結果ADAMTS-7和GEP相互作用，我們發(fā)現ADAM

15、TS-7、GEP和COMP形成一個調節(jié)軟骨細胞功能的蛋白質-蛋白質相互作用網。然而ADAMTS-7、生長因子GEP和細胞外基質COMP之間是如何相互作用，如何調控軟骨細胞分化和軟骨成骨的。 本文研究發(fā)現ADAMTS-7和ADAMTS-12是PTHrP調控通路中的新調控因子，同時也可調控軟骨細胞分化和軟骨內成骨。本文對ADAMTS-7、ADAMTS-12負調節(jié)軟骨分化的機制進行了初步探討，例如金屬蛋白酶ADAMTS-7和促軟骨分化