SCN1A基因截短突變患者的臨床分析及截短突變誘導的NMD機制研究.pdf

1、研究目的：
　　本研究選取Dravet綜合征（DS）患者SCN1A基因不同位置的截短突變位點，分析相應患者的臨床特點，通過構建相關minigene，進行無意義密碼子介導的mRNA降解(NMD)機制研究，以探討在SCN1A基因上不同位置的截短突變能否激發(fā)NMD機制，以及研究NMD與臨床表型的關系。
　　研究方法：
　　通過詳細收集攜帶SCN1A基因截短突變的Dravet綜合征（DS）患者的臨床資料及突變特點，構建融合表達

2、綠色熒光蛋白（GFP）和SCN1A基因截短突變的minigene。通過鑒定不同細胞系內源性抗性基因 Kana基因的表達，從而選取無 Kana基因表達的人宮頸癌細胞（Hela細胞）、人類神經母細胞瘤株細胞（SH-SY5Y細胞）、NGF誘導的褐家鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（NGF誘導的PC12細胞）作為轉染對象，通過脂質體法轉染技術，將野生型質粒及截短突變質粒分別轉染入上述三種細胞，提取總RNA，經反轉錄得cDNA，以cDNA為模板，Kana基

3、因及GAPDH基因為內參，進行熒光定量PCR（QPCR）。比較SCN1A基因的野生型及截短突變型質粒在三種細胞中的mRNA相對表達量，每組實驗重復三次獲得均值。相對定量數據處理采用2-△△Ct法，計量資料以均數±標準差(-X±S)表示，采用SPSS l7.0軟件包進行統計分析，單因素多樣本均數比較采用ANOVA分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。
　　結果：
　　1．臨床資料分析
　　攜帶 c.4526delA，c

4、.4547C>A，c.5280_5281delTG， c.5621_5622delGG截短突變位點的患者均診斷為SMEI，攜帶c.5540-5541insCCAG突變位點的患者診斷為 SMEB，無肌陣攣發(fā)作類型，其中攜帶 c.5540-5541insCCAG， c.5621_5622delGG的患者符合孤獨癥診斷，c.5540-5541insCCAG患者孤獨癥兒童行為量表(簡稱ABC量表)78分，兒童孤獨癥評定量表（簡稱CARS量表）3

5、6分，c.5621_5622delGG患者ABC量表110分，CARS量表41分。
　　2．PEGFP-C2-SCN1A–minigene野生型及突變型質粒構建和鑒定
　　將表達綠色熒光蛋白及SCN1A基因24至26號外顯子的DNA片段（包含25號內含子）連接到PEGFP-C2載體。PEGFP-C2-SCN1A-minigene質粒測序24至26號外顯子基因編碼區(qū)未發(fā)現突變，得到野生型 minigene，并構建c.4526d

6、elA，c.4547C>A，c.5280_5281delTG，c.5540-5541insCCAG，c.5621_5622delGG突變型minigene。
　　3.四種細胞系內源性Kana基因表達鑒定
　　HEK293細胞有內源性Kana基因表達，而NGF誘導的PC12細胞,Hela細胞,SH-SY5Y細胞均無內源Kana基因表達。
　　4.熒光定量PCR
　　以Kana基因作為內參基因，Hela細胞中野生型與

7、突變型c.4526delA，c.4547C>A， c.5280_5281delTG， c.5540-5541insCCAG， c.5621_5622delGG SCN1A基因 mRNA相對表達量分別為1.034±0.337，0.843±0.059（p>0.05），0.898±0.063（p>0.05），1.001±0.184（p>0.05），0.804±0.149（p>0.05），0.784±0.041（p>0.05）；SH-SY5Y細

8、胞中野生型與突變型 c.4526delA， c.4547C>A， c.5280_5281delTG，c.5540-5541insCCAG，c.5621_5622delGG SCN1A基因mRNA相對表達量分別為1.001±0.073，1.046±0.045（p>0.05），1.078±0.01（p>0.05），1.057±0.037（p>0.05），1.051±0.029（p>0.05），1.204±0.088（p>0.05）；NGF誘

9、導的PC12細胞中野生型與突變型c.4526delA，c.4547C>A，c.5280_5281delTG， c.5540-5541insCCAG， c.5621_5622delGG SCN1A基因mRNA相對表達量分別1.01±0.174，0.67±0.118（p<0.05），0.665±0.067（p<0.05），0.684±0.102（p<0.05），0.934±0.046（p>0.05），0.634±0.084（p<0.05）；

10、以GAPDH基因為內參基因， NGF誘導的PC12細胞中野生型與突變型 c.4547C>A，c.5280_5281delTG， c.5540-5541insCCAG， c.5621_5622delGG SCN1A基因mRNA相對表達量分別1.014±0.173，0.079±0.02（p<0.05），0.3±0.072（p<0.05），0.299±0.075（p<0.05），0.232±0.034（p<0.05）。
　　結論：