Wnt信號通路在小鼠內(nèi)耳中的表達及對具有干-祖細胞樣細胞特性的Wnt反應(yīng)細胞的調(diào)控.pdf

1、本研究共分為三部分。
　　第一部分 小鼠內(nèi)耳Wnt信號的基因表達研究
　　目的:Wnt信號通道可調(diào)控干細胞的自我更新和分化。目前研究表明，Wnt信號通路可調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，胃腸道系統(tǒng)，心臟系統(tǒng)，骨骼系統(tǒng)，乳腺干細胞，皮膚干細胞，造血干細胞，胚胎干細胞以及其他系統(tǒng)器官干細胞功能。為了解經(jīng)典Wnt信號通道在調(diào)控內(nèi)耳毛細胞再生中所起的作用，本章先檢測Wnt信號通道下游靶基因Axin2在小鼠內(nèi)耳的表達，為進一步研究提供基礎(chǔ)。

2、　　方法:通過利用野生型和作為經(jīng)典Wnt信號通道激活表現(xiàn)模型的雜合子Axin2-LacZ轉(zhuǎn)基因小鼠，1.以新生和成年小鼠作為研究對象，無菌條件下取出聽泡，X-gal染色后行冰凍切片，以觀察Axin2基因在內(nèi)耳中表達的部位及表達部位的細胞種類，或者直接做冰凍切片，用各種不同細胞標志物（毛細胞，支持細胞，上皮細胞，間質(zhì)細胞，增殖細胞）行免疫組化染色以鑒定細胞表型。2.分別在野生型小鼠出生1天(P1)、P7、P21、P28體內(nèi)注射Edu(50

3、mg/kg)，2天后取出聽泡冰凍切片或者整個橢圓囊觀察Edu陽性細胞位置和數(shù)目以了解耳蝸內(nèi)具自我增殖潛力的細胞種類和不同年齡的增殖能力。3.分別取出耳蝸和橢圓囊，以X-gal染色，或行RT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附實驗，以觀察Axin2基因表達隨年齡的變化。
　　結(jié)果:實驗發(fā)現(xiàn)Wnt信號在新生小鼠耳蝸中基底膜以下的Tympanic border cells(TBCs)中表達，TBCs不表達成熟上皮細胞，毛細胞和支持細胞標志。在新生小鼠

4、有活躍增殖細胞標志，間質(zhì)細胞標志。Wnt信號表達與增殖能力一致隨年齡迅速下降，出生3周后消失。而在前庭器官橢圓囊中，Wnt信號在間質(zhì)細胞(stromal cells)中表達，具有間質(zhì)細胞，和增殖細胞標志并隨年齡增大，Axin2基因表達水平和細胞增殖能力下降緩慢，但在成年小鼠中仍有表達。
　　結(jié)論:Wnt信號在小鼠耳蝸TBCs，橢圓囊間質(zhì)細胞中均有表達。與在新生小鼠耳蝸中表達相比，成年小鼠橢圓囊中Wnt信號持續(xù)存在。目前研究已經(jīng)證實

5、成年小鼠橢圓囊可再生毛細胞，提示W(wǎng)nt信號的表達對毛細胞再生有著重要的意義。
　　第二部分 新生小鼠耳蝸Axin2表達細胞自我增殖和分化功能及Wnt信號通道對其調(diào)控的研究
　　目的:在哺乳動物耳蝸中，毛細胞僅在胚胎時期和新生小鼠中具有非常有限的再生能力。在耳蝸內(nèi)尋找有干細胞潛能的細胞從而替代失去的毛細胞，恢復(fù)聽力損失迫在眉睫。我們通過體內(nèi)和體外實驗，研究新生小鼠耳蝸Wnt信號表達細胞TBCs的自我增殖和分化功能，及Wnt信號

6、通道對其的調(diào)控作用。
　　方法:通過利用雜合子Axin2-LacZ轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠，1.無菌條件下取40-50只P0-P3 Axin2lacZ/+小鼠耳蝸，通過β-galatosidase，3-carboxyumbeliferylβ-D-galactopyranoside的酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)將Axin2高表達細胞標記上CasBlue染料，再通過流式細胞儀鑒定分離Axin2高表達細胞和低表達細胞，以RT-PCR，q-PCR確定A

7、xin2基因在分離后的高表達和低表達細胞中的表達。2.將分離出的細胞分別在體外無血清非粘附的含生長因子EGF，IGF-1，bFGF，and heparin sulfate的完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，5天后比較Axin2高表達細胞和低表達細胞形成的克隆球以觀察自我增殖能力。將分離出的細胞在完全培養(yǎng)液和飼養(yǎng)細胞條件下體外培養(yǎng)10天后用毛細胞，支持細胞，增殖細胞標志行免疫組化染色以鑒定細胞的分化及分化細胞的表型。3.無菌條件下取P3野生型小鼠耳蝸于完

8、全培養(yǎng)基中，分別加入純化的Wnt信號通道的激動劑Wnt3a(200ng/ml)，R-spondin1(1ug/ml)和抑制劑Fz8CRD(25ug/ml)體外培養(yǎng)3-5天，最后12小時于培養(yǎng)基中加入Edu（25ng/ml），免疫組化實驗觀察Wnt對耳蝸細胞自我增殖的作用。與增殖能力相一致，在Wnt信號通道激動劑和抑制劑培養(yǎng)3天后行酶聯(lián)免疫吸附實驗觀察Axin2的表達水平。
　　結(jié)果:通過流式細胞術(shù)分離的耳蝸內(nèi)Axin2高表達細胞在

9、體外培養(yǎng)中形成上皮細胞島的數(shù)目是Axin2低表達細胞的3倍，并且其細胞島內(nèi)的增殖標志陽性細胞較低表達細胞明顯活躍表達。同時Axin2高表達細胞可分化為新生的有毛細胞表達標志和支持細胞表達標志的細胞。而酶聯(lián)免疫吸附實驗顯示W(wǎng)nt信號通道激活劑和抑制劑可增加或減少β-galatosidase在新生小鼠耳蝸中的表達。且Wnt3a，R-spondin1可使TBCs區(qū)域的Edu陽性細胞數(shù)目為對照組的2倍，F(xiàn)z8CRD則使之減少至對照組的1/2。<

10、br>　　結(jié)論:新生小鼠耳蝸中Wnt信號的表達細胞-TBCs，具有自我增殖和分化的能力，提示TBCs具有干/祖細胞的特性，并且為Wnt信號通路所調(diào)控。
　　第三部分 小鼠橢圓囊Axin2表達細胞增殖分化功能及Wnt信號通道對其調(diào)控的研究
　　目的:目前已經(jīng)證實，在成年哺乳動物中區(qū)別于耳蝸，前庭器官毛細胞仍然有再生能力，并存在有干細胞潛能的細胞。我們通過對橢圓囊中Wnt信號表達細胞的研究，以探索Wnt信號通路在新生和成年小鼠橢

11、圓囊中對其增殖分化的調(diào)控。
　　方法:通過利用野生型小鼠，雜合子Axin2-LacZ轉(zhuǎn)基因小鼠和Axin2-cre雜交mTmG(membrane-Tdtomato-membrane-GFP)小鼠，1.無菌條件下取P3和P30 Axin2LacZ/+小鼠橢圓囊，分別加入Rspondin-1(1ug/ml)，F(xiàn)z8CRD(25ug/ml)在完全培養(yǎng)液中體外培養(yǎng)3天，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗觀察β-galatosidase濃度和q-PCR實

12、驗觀察Axin2基因表達水平，以了解Wnt信號通路激動劑和抑制劑在內(nèi)耳橢圓囊中的作用。2.上述條件體外培養(yǎng)橢圓囊，在最后12小時于培養(yǎng)基中加入Edu（25ng/ml），免疫染色實驗觀察Wnt信號對橢圓囊細胞自我增殖的影響。3.體內(nèi)譜系追蹤Axin2表達細胞。通過利用Axin2-Cre小鼠與mTmG(membrane-Tdtomato-membrane-GFP)小鼠的雜交后代，cre-loxp重組酶系統(tǒng)在沒有激活的情況下所有細胞為紅色，表

13、達Tdtomato。在新生和成年小鼠中注射枸櫞酸他莫昔芬(4mg/25g)激活Cre-loxp系統(tǒng)后，所有的Axin2表達細胞被激活，其中GFP基因代替Tdtomato表達，僅在Axin2陽性細胞中表達GFP的綠色信號。P3小鼠注射他莫昔芬32天后，成年小鼠50天后取出小鼠聽泡，冰凍切片后免疫組織化學染色，譜系追蹤Axin2表達細胞，以觀察Axin2表達細胞是否具有干細胞/祖細胞特性。
　　結(jié)果:體外完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)P3和P30小

14、鼠橢圓囊發(fā)現(xiàn)均有明顯的增殖能力。在P3小鼠中增殖細胞平均分布在橢圓囊中，P30小鼠中增殖細胞僅僅在strialor區(qū)域表達。酶聯(lián)免疫吸附和q-PCR實驗均顯示W(wǎng)nt信號通道激活劑R-spondin1和抑制劑Fz8CRD可調(diào)節(jié)β-galatosidase及Axin2基因在新生和成年小鼠中的表達。經(jīng)加入R-spondin1和Fz8CRD體外培養(yǎng)橢圓囊可以明顯增加和減少其增殖能力，說明其增殖為Wnt系統(tǒng)調(diào)控。通過譜系追蹤Axin2陽性細胞，追