JWA基因參與K562細胞應(yīng)答氯化高鐵血紅素和熱應(yīng)激作用的可能機制.pdf

1、人類疾病往往是環(huán)境因素與遺傳因素共同作用的結(jié)果，探討基因與環(huán)境的相互作用機制與規(guī)律，對于防治環(huán)境因素造成的機體危害具有重要意義。 為了進一步深入了解JWA基因與紅白血病的關(guān)系，本課題用hemin、熱應(yīng)激及hemin與熱應(yīng)激聯(lián)合處理K562細胞，觀察JWA基因在這些細胞模型中表達的特點和規(guī)律，探討JWA在細胞應(yīng)答hemin和應(yīng)激信號通路中的作用和分子機制，以期為發(fā)展新的物理療法與化療結(jié)合治療紅白血病提供依據(jù)。 一、JWA對h

2、emin處理K562細胞的應(yīng)答：建立hemin誘導(dǎo)K562細胞向紅系分化的細胞模型：用不同濃度hemin處理K562細胞不同時間，以測定血紅蛋白的相對表達含量來確定細胞模型建立的成功。用RT-PCR方法檢測JWAmRNA表達變化；用Westernblot方法檢測JWA蛋白表達。 二、JWA基因?qū)釕?yīng)激處理K562細胞的應(yīng)答：熱應(yīng)激(42℃)處理K562細胞2h，K562細胞無明顯變化。用42℃水浴處理K562細胞不同時間(10、

3、30、45、60、90和120min)，作用30min可使JWAmRNA水平表達顯著增加1.87±0.13倍；作用120min，JWA蛋白表達水平明顯增高7.00±1.73倍。 三、JWA基因?qū)emin與熱應(yīng)激聯(lián)合作用K562細胞的應(yīng)答：以30μMhemin處理K562細胞48h，然后42℃水浴30min，JWAmRNA表達雖有所增加，但低于hemin或熱應(yīng)激的單獨處理時的表達水平。 四、JWA基因應(yīng)答hemin和熱應(yīng)

4、激的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)：為了探討hemin和熱應(yīng)激對JWA表達調(diào)節(jié)是否通過其激活的核轉(zhuǎn)錄因子與JWA基因啟動子反應(yīng)元件結(jié)合而實現(xiàn)的，根據(jù)JWA基因啟動子所含有的不同的反應(yīng)元件，分別構(gòu)建的含JWA部分啟動子的P1、P2、P3以及pCAT質(zhì)粒。質(zhì)粒P1含有hemin和熱休克反應(yīng)元件；質(zhì)粒P2僅含有熱休克反應(yīng)元件，不含hemin反應(yīng)元件；質(zhì)粒P3兩個反應(yīng)元件均不包含。用無啟動子的空CAT質(zhì)粒pCAT作為對照質(zhì)粒，3種報告載體與參照質(zhì)粒β-gal按4∶1

5、的比例分別共轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染細胞6h后，加入hemin(終濃度為30μM)繼續(xù)培養(yǎng)48h，再42℃處理30min。經(jīng)hemin、熱應(yīng)激單獨處理以及hemin和熱應(yīng)激聯(lián)合作用后，質(zhì)粒P1、P2的轉(zhuǎn)錄活性均明顯高于對照。質(zhì)粒P1在hemin誘導(dǎo)處理后，其轉(zhuǎn)錄活性顯著增高，質(zhì)粒P2則不論單獨或聯(lián)合處理，其轉(zhuǎn)錄活性均升高。 五、JWA基因參與應(yīng)答hemin和熱應(yīng)激的相關(guān)信號通路：用MEK-1的抑制劑PD98059可以抑制hemin誘導(dǎo)K5